Sitosolik Kalsiyum Ölçümleri ve Kalsiyum Görüntüleme Çalışmaları için Beyin Kılcal Perisit Kültürü
Summary
Beyin kılcal perisitler kan-beyin bariyer özellikleri ve kan akışının düzenlenmesinde önemli oyunculardır. Bu protokol, beyin kapiller perisitlerin nasıl izole edilebildiğini, kültürlü, hücre tipine göre karakterize ve floresan problarla hücre içi kalsiyum sinyalizasyonunun araştırılması için nasıl uygulanabileceğini açıklamaktadır.
Abstract
Perisitler nörovasküler birim (NVU) olarak bilinen bir yapıda endotel hücreleri ve astrositik endfeet ile ilişkilidir. Beyin kılcal perisit fonksiyonu tam olarak bilinmemektedir. Perisitlerin kapiller gelişim, endotel bariyer sıkışması ve transitez aktivitesinin düzenlenmesi, kapiller tonun düzenlenmesi ve bazı beyin patolojilerinde önemli rol oynamaları ile ilgili olduğu ileri sürülmüştür.
Perisitler beyin parankim süreçlerinde görme zorlukları nedeniyle bozulmamış beyinde araştırmak için zor, yanı sıra NVU diğer hücrelere yakın. Bu protokol, beyin sinyalizasyonu ve patolojilerinde yer alan agonistlerin etkilerinin araştırılabildiği kalsiyum görüntüleme çalışmalarında birincil sığır beyin kılcal damarlarının izolasyonu ve kültürü ve aşağıdaki kullanımları için bir yöntem tanımlamaktadır. Kortikal kılcal damar parçaları kültür şişelerinin altına takılmak için izin verilir ve, 6 gün sonra, endotel hücreleri ve perisitler kılcal parçalar dan dışarı büyüdü. Endotel hücreleri nazik tripsinizasyon ile çıkarılır ve perisitler passaging önce 5 gün daha kültürlenir.
İzole perisitler 96-iyi kültür plakaları içinde tohumlu ve kalsiyum indikatör boya ile yüklenir (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) bir plaka okuyucu kurulum hücre içi kalsiyum düzeylerinin ölçümleri için izin vermek için. Alternatif olarak, perisitler kapaklara tohumlanır ve hücre odalarına monte edilir. Kalsiyum indikatörü (Cal-520 AM) ile yüklendirin ardından, kalsiyum canlı görüntüleme 488 nm uyarma dalga boyunda ve 510-520 nm emisyon dalga boyunda konfokal mikroskopi ile yapılabilir.
Burada açıklanan yöntem, primer beyin kapiller perisitlerden ilk hücre içi kalsiyum ölçümlerini elde etmek için kullanılmıştır, perisitlerin ATP ile uyarıldığını ve in vitro olarak bulaşabildiğini göstermiştir.
Introduction
Beyin kapiller perisitler, endotel hücreleri ve astrositler ile birlikte, NVU1,2,3oluşturmaktadır. Kılcal damarların yapısal temelini oluşturan endotel hücreleri, çapı 5-8 m olan uzun silindirik tüpler oluştururlar. Endotel hücreleri düzensiz perisitlerle kaplıdır ve astrositlerden gelen çıkıntılarla çevrilidir; astrosit endfeet.
Kan-beyin bariyeri (BBB), beyin kılcal damarlarında bulunan, besin alışverişi için ana site, gazlar ve beyin ve kan arasında atık ürünler. BBB aynı zamanda endojen ve eksojen nörotoksinlerden beyni korur ve çok sayıda ilaç bileşiminin teslimi için bir engel görevi görehizmet eder. Bariyer fonksiyonu merkezi sinir sistemi (CNS) ilaçları geliştiren ilaç şirketleri için bir odak alanı, hem de bir engeldir. Bu kültür4NVU hücreleri soruşturma büyük bir ilgi mahmuzlu vardır. Beyin astrositleri ve endotel hücreleri bir dizi çalışmada kültürlenmiş ve karakterize edilmiş, perisit kültürü için çalışmalar ve protokoller seyrek tir.
Daha önce yayınlanan protokoller bir dereceye kadar beyin kılcal perisit kültürlerin nesil açıklanan, immünpanning gibi farklı yaklaşımlar bir dizi kullanarak5, yüksek- ve düşük glikoz medya6, floresan-aktive hücre sıralama7, yoğunluk gradyan santrifüj8, vb. Bu yöntemler perisit kültürlerini elde etmek için yeterli görünse de, bazıları zaman alıcı, pahalı ve elde edilen perisitler perisitleri farklılaştırabilen kültür pasajlarının sayısı nedeniyle ideal olmayabilir9. Ayrıca, in vitro sinyalizasyon çalışmalarında kültürlü perisitlerin potansiyeli şimdiye kadar keşfedilmemiştir.
Bu çalışma izole sığır beyin kılcal damarlarından perisit kültürlerin üretimi ve hücre içi kalsiyum değişiklikleri ölçümleri ve görüntüleme çalışmaları için sonraki kurulum üzerinde duruluyor, önemli bir hücre içi ikinci haberci. Kılcal damarların kortikal gri maddeden izolasyonunu kısaca anlatıyoruz (ayrıntılar için helms vd.10)ve perisitlerin izolasyonve kültürünü endotel veya glial hücrelerle kontaminasyon olmadan saf monokültürde tanımlıyoruz. Daha sonra 96-iyi plakalar ve kalsiyum probu Fura-2 için yükleme protokolleri perisit tohumlama için bir protokol sağlar. Son olarak, perisitlerin mikroskop kültür odalarında gerçek zamanlı konfokal görüntülemede nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz ve bunun protokollerini tanımlıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, primer perisitleri büyükbaş beyinlerden izole etmek için bir yöntem sunduk. Açıklanan protokol, bu aksi takdirde erişilemeyen hücre tipi nin kültürüne izin verir. Daha sonra elde edilen hücre kültürü perisitlerin neredeyse homojen bir popülasyon, çok az veya hiç hücre morfolojisi ve protein ekspresyonuna dayalı glial hücreler ile kontaminasyon oldu12. Ayrıca, perisitleri ca2+görüntüleme için kalsiyum boyalarla doldurmak için basit ve basit bi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Beyin Bariyerleri ve İlaç Dağıtım Lundbeck Vakfı Araştırma girişimi (RIBBDD) ve Simon Hougners Aile Vakfı fon kabul etmek istiyorum.
Materials
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
Referencias
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
- Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
- Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
- Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).
- Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
- Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
- Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
- Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
- Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).
