Casting vascolare di polmoni di mouse postnatali adulti e precoci per l'imaging Micro-CT
Summary
Lo scopo di questa tecnica è la visualizzazione ex vivo delle reti arteriliiche polmonari dei primi topi postnatali e adulti attraverso l’inflazione polmonare e l’iniezione di un composto a base di polimeri radio-opaco attraverso l’arteria polmonare. Vengono inoltre discusse le potenziali applicazioni per i tessuti castati.
Abstract
I vasi sanguigni formano reti intricate nello spazio tridimensionale. Di conseguenza, è difficile apprezzare visivamente il modo in cui le reti vascolari interagiscono e si comportano osservando la superficie di un tessuto. Questo metodo fornisce un mezzo per visualizzare la complessa architettura vascolare tridimensionale del polmone.
Per raggiungere questo obiettivo, un catetere viene inserito nell’arteria polmonare e la vascolatura viene simultaneamente lavata di sangue e dilatata chimica per limitare la resistenza. I polmoni vengono poi gonfiati attraverso la trachea a una pressione standard e il composto polimerico viene infuso nel letto vascolare ad una velocità di flusso standard. Una volta che l’intera rete arteriosa è stata riempita e autorizzata a curare, la vascolatura polmonare può essere visualizzata direttamente o su uno scanner micro-CT.
Quando eseguito con successo, si può apprezzare la rete arteriosa polmonare nei topi che vanno dalle prime età postnatali agli adulti. Inoltre, mentre dimostrato nel letto arteriosa polmonare, questo metodo può essere applicato a qualsiasi letto vascolare con posizionamento del catetere ottimizzato e punti finali.
Introduction
Il focus di questa tecnica è la visualizzazione dell’architettura arteriosa polmonare utilizzando un composto a base di polimeri nei topi. Mentre è stato eseguito un ampio lavoro su letti vascolari sistemici come cervello, cuore e rene1,2,3,4,5, sono disponibili meno informazioni per quanto riguarda la preparazione e il riempimento della rete arteriosa polmonare. Lo scopo di questo studio, quindi, è quello di ampliare il lavoroprecedente 6,7,8 e fornire un riferimento scritto e visivo dettagliato che i ricercatori possono facilmente seguire per produrre immagini ad alta risoluzione dell’albero arteriosa polmonare.
Mentre esistono numerosi metodi per l’etichettatura e l’imaging della vascolatura polmonare, come la risonanza magnetica, l’ecocardiografia o l’angiografiaTC 9,10, molte di queste modalità non riescono a riempire adeguatamente e/o catturare i piccoli vasi, limitando la portata di ciò che può essere studiato. Metodi come la sezionazione seriale e la ricostruzione forniscono alta risoluzione, ma sono tempo/lavoro ad altaintensità di tempo 11,12,13. L’integrità dei tessuti molli circostante è compromessa nella colata di corrosionetradizionale 10,,13,14,15,16. Anche l’età e le dimensioni degli animali diventano fattori quando si tenta di introdurre un catetere o, la risoluzione è carente. La tecnica di iniezione polimerica, d’altra parte, riempie le arterie al livello capillare e, se combinata con la CT, consente una risoluzione senza precedenti5. I campioni dei polmoni di topo giovani come il giorno postnatale 14 sono stati lanciaticon successo 8 ed elaborati in poche ore. Questi possono essere riscanci a tempo indeterminato, o addirittura inviati per preparazione irologica/ microscopia elettronica (EM) senza compromettere il tessuto molleesistente 17. Le principali limitazioni di questo metodo sono il costo iniziale delle apparecchiature/software CT, le sfide con il monitoraggio accurato della pressione intravascolare e l’incapacità di acquisire dati longitudinalmente nello stesso animale.
Questo documento si basa sul lavoro esistente per ottimizzare ulteriormente la tecnica di iniezione dell’arteria polmonare e spingere i confini relativi all’età/dimensione fino al giorno postnatale 1 (P1) per produrre risultati sorprendenti. È più utile per i team che vogliono studiare le reti vascolari arteriose. Di conseguenza, forniamo nuove linee guida per il posizionamento/stabilizzazione del catetere, un maggiore controllo sulla frequenza/volume di riempimento ed evidenziamo notevoli insidie per un maggiore successo di colata. I cast risultanti possono quindi essere utilizzati per la caratterizzazione futura e l’analisi morfologica. Forse ancora più importante, questa è la prima dimostrazione visiva, a nostra conoscenza, che guida l’utente attraverso questa procedura complessa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eseguito correttamente, questo metodo produce immagini sorprendenti di reti arteriose polmonari, consentendo il confronto e la sperimentazione nei modelli di roditori. Diversi passaggi critici lungo il percorso garantiscono il successo. In primo luogo, i ricercatori devono eparinizzare l’animale nella fase preparatoria per evitare che si forno coaguli di sangue nella vascolatura polmonare e nelle camere del cuore. Ciò consente il transito arteriosa completo del composto polimero. In secondo luogo, quando si perfora il d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale NHLBI (DIR HL-006247). Ringraziamo il NIH Mouse Imaging Facility per la guida nell’acquisizione e nell’analisi delle immagini.
Materials
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma – Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | SkyScan | 1172 | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B – MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
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