Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen

Studies hebben aangetoond dat bruin vetweefsel (BBT) een opmerkelijke capaciteit heeft om energie te verdrijven. Er bestaan twee soorten thermogene adipocyten met verschillende ontwikkelingskenmerken bij zowel knaagdieren als mensen: beige adipocyten en klassieke bruine adipocyten. Terwijl klassieke bruine adipocyten zich meestal in intercapulaire BAT-depots bevinden, komen beige adipocyten sporadisch naar voren in wit vetweefsel (WAT) in reactie op bepaalde fysiologische signalen, zoals chronische koude blootstelling, een proces dat wordt aangeduid als “bruinen” of “beiging”. Door het gebruik van geavanceerde beeldvorming is het nu duidelijk dat volwassen mensen aanzienlijke depots van UCP1⁺ BAT hebben, vooral in supraclaviculaire regio^1,2,3,4. De hoeveelheid volwassen menselijke BAT omgekeerd correleert met adipositeit en kan worden verhoogd door externe signalen, zoals chronische blootstelling aan koude^5,,6 of β3-adrenerge receptor agonist⁷. Door baten gemedieerde energie-uitgaven kunnen een levensvatbare aanpak bieden om obesitas te bestrijden.

Tot voor kort werden thermogene adipocyten beschouwd als een homogene populatie. Studies hebben echter het bestaan van meerdere subtypen of subpopulaties aan het licht gebracht die verschillen in ontwikkelingsoorsprong, substraatgebruik en transcriptome^8,9,10. Bijvoorbeeld, een soort beige adipocyte die bij voorkeur glucose gebruikt voor thermogenese, de g-beige adipocyte, werd onlangs beschreven¹⁰. Het onvolledige begrip van celtypen in bruin en beige vetweefsel en het ontbreken van specifieke markers vormen een kritieke barrière voor het bestuderen van hun biologische functies.

Traditionele methoden voor het isoleren van subpopulaties van cellen zijn gebaseerd op expressie van slechts een paar bekende markergenen. Recente vooruitgang in eencellige genomics maakt het gebruik van wereldwijde genexpressiegegevens van enkele cellen mogelijk om een onbevooroordeelde schatting te geven van het aantal subpopulaties in een weefsel. Het uiteindelijke doel van dit protocol is om alle vetweefsel subtypes te bepalen onder verschillende thermogene stimuli op een eencellige resolutie. In tegenstelling tot andere weefsels en celtypen is het bepalen van cellulaire subtypes van vetweefsel een uitdaging vanwege de kwetsbaarheid van met lipide gevulde adipocyten. Dit papier introduceert een robuust protocol om enkele kernen te isoleren van vetweefsel voor downstream-toepassing op snRNA-sequencing. Belangrijk is dat recente literatuur die goed overeenkomende single-nuclei RNA sequencing (snRNA-seq) en single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) datasets te vergelijken bleek dat snRNA-seq is vergelijkbaar met scRNA-seq in celtype detectie, en superieur in cellulaire dekking voor een complex weefsel als de hersenen¹¹. Dit protocol combineert een dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode geoptimaliseerd voor vetweefsel door Rosen et al.¹² met een kern “cleanup” stap met een MoFlo XDP High Speed Sorter. Zoals te zien in de representatieve resultaten, een analyse van 7.500 enkele kernen van de muis interscapulaire bruin vetweefsel geïdentificeerd meerdere celtypes binnen schijnbaar homogene bruine adipocyten. Over het algemeen kan dit eenvoudige en robuuste protocol worden toegepast om weefsel-niveau organisatie van adipocyten en vet-ingezeten cellen, identificatie van subtype-specifieke marker genen, en ontwikkeling fenotypering van vet-selectieve knock-out / transgene muizen te bestuderen.