Beoordeling van de globale oculaire structuur na de ruimtevaart met behulp van een micro-computertomografie (Micro-CT) Imaging Methode
Summary
We presenteren een protocol met behulp van hoge-resolutie micro-computertomografie imaging om te bepalen of ruimtevlucht veroorzaakte schade aan oculaire structuren. Het protocol toont de micro-CT-afgeleide meting van ex vivo knaagdier oculaire structuren. We tonen de mogelijkheid om oculaire morfologische veranderingen na de ruimtevaart te beoordelen met behulp van een niet-destructieve driedimensionale techniek om oculaire schade te evalueren.
Abstract
Rapporten tonen aan dat langdurige blootstelling aan een ruimtevlucht omgeving produceert morfologische en functionele oogheelkundige veranderingen in astronauten tijdens en na een International Space Station (ISS) missie. Echter, de onderliggende mechanismen van deze ruimtevlucht geïnduceerde veranderingen zijn momenteel onbekend. Het doel van deze studie was om de impact van de ruimtevlucht omgeving op oculaire structuren te bepalen door de evaluatie van de dikte van de muis netvlies, het netvlies pigment epitheel (RPE), de choroïde en de sclera laag met behulp van micro-CT beeldvorming. Tien weken oude C57BL/6 mannelijke muizen werden ondergebracht aan boord van het ISS voor een 35-daagse missie en vervolgens levend terug naar de aarde voor weefselanalyse. Ter vergelijking, grondcontrole (GC) muizen op aarde werden gehandhaafd in identieke omgevingsomstandigheden en hardware. Oculaire weefselmonsters werden verzameld voor micro-CT-analyse binnen 38(±4) uur na splashdown. De beelden van de dwarsdoorsnede van het netvlies, de RPE, de choroïde en de scleralaag van het vaste oog werden opgenomen in een axiale en sagittale weergave met behulp van een micro-CT-beeldacquisitie-acquisitiemethode. De micro-CT-analyse toonde aan dat de dwarsdoorsnede gebieden van het netvlies, RPE, en choroïde laag dikte werden veranderd in spaceflight monsters in vergelijking met GC, met spaceflight monsters tonen aanzienlijk dunnere dwarsdoorsnedes en lagen in vergelijking met controles. De bevindingen van deze studie geven aan dat micro-CT-evaluatie een gevoelige en betrouwbare methode is om veranderingen in de oculaire structuur te karakteriseren. Deze resultaten zullen naar verwachting het inzicht in de impact van milieustress op de mondiale oculaire structuren verbeteren.
Introduction
In de microzwaartekracht omgeving van de ruimtevaart, verhoogde intracraniale druk (ICP) veroorzaakt door vloeistof verschuiving kan hebben bijgedragen aan ruimtevlucht-geassocieerde neuro-oculair syndroom (SANS)1,2,3,4,5. Meer dan 40% van de astronauten heeft namelijk SANS ervaren tijdens en na een International Space Station (ISS) missie6, inclusief het ruimtevluchtonderwerp van de NASA Twins Study7. De huidige pathofysiologie van SANS omvat fysiologische veranderingen zoals optische schijf oedeem, globe flattening, choroïdale en retinale plooien, hyperopische refractieve foutverschuivingen, en zenuwvezel laag infarcten (dat wil zeggen, watten vlekken) en zijn goed gedocumenteerd5,8. De onderliggende mechanismen van de veranderingen en factoren die bijdragen aan de ontwikkeling van schade zijn echter onduidelijk. Om een beter begrip van SANS te hebben, zijn er diermodellen beschikbaar om de ruimtevluchtgerelateerde veranderingen in de retinale structuur en functie te karakteriseren.
In een eerder onderzoek naar dezelfde dieren, rapporteerden we de impact van 35 dagen ruimtevlucht op het muisnetvlies. De resultaten verduidelijken dat de ruimtevaart aanzienlijke schade veroorzaakt in het netvlies en retinale vasculatuur, en sommige eiwitten / trajecten geassocieerd met celdood, ontsteking en metabole stress werden aanzienlijk veranderd na spaceflight9.
Momenteel zijn er een verscheidenheid van niet-invasieve beeldvorming technieken vastgesteld om de ontwikkeling en progressie van de ziekte te controleren, evenals fysiologische reacties op verschillende milieustressoren, die ook op grote schaal worden gebruikt in kleine knaagdier modellen. Een van deze technieken is micro-CT, die anatomische structuren en pathologische processen evalueert, en met succes is gebruikt op organismen zo klein als muizen10.
Micro-CT kan een gemicrosiseerde resolutie bereiken en kan een hoog contrast bieden voor volumetrische analyse van zachte weefsels met de toevoeging van het juiste contrastmiddel10,11,12,13,14. Micro-CT-technologie is voordelig in vergelijking met traditionele methoden zoals bruto anatomie, lichtmicroscopie en histologieonderzoek, omdat het fysieke schade aan het geometrische profiel van de specimens minimaliseert en de ruimtelijke relatie tussen structuren niet verandert. Daarnaast kunnen driedimensionale (3D) modellen van structuren worden gereconstrueerd uit micro-CT-beelden12,14. Tot op heden zijn er, ondanks gegevens waaruit blijkt dat het gezichtsvermogen na blootstelling aan de ruimteomgeving, weinig gegevens in diermodellen beschikbaar zijn voor een beter begrip van de veranderingen in de retinale structuur en functie van de ruimtevaart. In de huidige studie, muizen werden gevlogen op een 35-daagse missie aan boord van het ISS om de impact van de ruimtevlucht omgeving op oculaire weefselstructuren te bepalen door het kwantificeren van de microstructuur van het netvlies, de RPE, en de choroïde lagen met behulp van micro-CT.
Protocol
Representative Results
Discussion
De resultaten van deze studie toonden aan dat er structurele veranderingen in de spaceflight muis oog met behulp van de micro-CT-techniek in vergelijking met GC-groepen, met name van het netvlies, de RPE, en de choroïde lagen van het oog, zoals blijkt uit hun verminderde dikte. Micro-CT biedt een efficiënte en niet-destructieve techniek om de veranderingen te karakteriseren zonder manipulatie. Het gebruik van PMA-kleuring verbeterde de kwaliteit van de micro-CT-beelden om duidelijke 3D-tomografische beelden na de reconstructie te verkrijgen, waarbij elke noodzaak om de structuur van het monster fysiek te veranderen, wordt afgewisseld. Een bijkomend voordeel van deze beelden is dat ze de hele regio van belang digitaal weergeven, waardoor de toegankelijkheid en reproduceerbaarheid van de bevindingen toenemen. Door de micro-CT beelden geproduceerd tijdens deze studie, het beoogde exemplaar toonde differentiatie van de meerdere structuren zoals het netvlies, RPE, choroïde, en sclera laag voor de bepaling van de dikte van elke laag.
Een kritieke stap binnen het protocol is de manipulatie van de monsters vanwege hun grootte en textuur. De behandeling van het monster moet zorgvuldig worden gedaan zonder druk uit te oefenen op het monster tijdens de bereiding. De micro-CT heeft een aantal beperkingen: resolutie en het gebrek aan gestandaardiseerde waarden voor de parameters. Tijdens het scannen kunnen de verschillende micro-CT-scanners verschillende beeldverwerkingsalgoritmen hebben; toch kan kalibratie voor een grijswaarden worden nagestreefd om elk probleem te overwinnen. Na het scannen moet de reconstructie van de beelden worden gebaseerd op het weefsel en de analyse die zal worden uitgevoerd. Het kan van cruciaal belang zijn omdat de beeldkwaliteit afhangt van het tomografische systeem, de instellingen, de grootte van het monster en de bereidingsmethoden16,17.
Vanwege de succesvolle toepassing ervan bij het bestuderen van verschillende soorten normale en pathologische weefsels, moeten micro-CT-beeldvormingsmogelijkheden worden gebruikt in toekomstig onderzoek om volumetrische gegevens voor andere analyses samen te stellen. Op basis van het doel van deze studie was het dus aanvaardbaar om tweedimensionale metingen te gebruiken, maar segmentatie van de bruto 3D-structuur kan ook nuttig zijn om een nauwkeurige schets van het gehele specimen te geven. Zelfs met alle voordelen van een niet-destructieve techniek zal micro-CT andere methoden zoals immunohistochemie niet vervangen, maar zal het desgewenst volgende histologieanalyses aanvullen en toestaan.
Een langdurige ruimtevlucht voorwaarde produceert een reeks structurele en functionele oculaire veranderingen in de astronauten tijdens en na de ruimtemissie gedefinieerd als SANS. De bevindingen omvatten hyperopische verschuivingen, globe flattening, choroidal / retinale plooien, en watten vlekken19. In tegenstelling tot astronauten ‘ optische coherentie tomografie (OCT) het vinden van retinale zenuwvezel laag verdikking, dunner worden van netvlies en choroïdale laag werd gedocumenteerd in deze dierlijke micro-CT studie. Deze resultaten waren onverwacht. Deze discrepantie kan te wijten zijn aan verwarrende factoren. Muizen hebben een beperkte cephalad vloeistof verschuiving in vergelijking met de mens. Dit gebrek aan vloeistofverschuiving kan verschillende reacties op gravitatieveranderingen hebben opgeroepen. Ten tweede werden muizen binnen 38 uur na splashdown ontleed, en een acute reactie op heraanpassing kan ook bijdragen aan morfologische veranderingen in het netvlies en chooïde. Bevestiging van deze mogelijkheid vereist verdere metingen tijdens de ruimtevaart en lange termijn na de missie.
De resultaten van deze studie geven aan dat de omstandigheden van de ruimtevaart, met name gravitatieveranderingen, een acute en korte-termijnrespons in het oog kunnen veroorzaken. Verder onderzoek is nodig om de gevolgen van de acute veranderingen op de oculaire op retinale functie en mechanisme van ruimtevlucht-geïnduceerde structuur veranderingen te bepalen.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door NASA Space Biology grant # NNX15AB41G en LLU Department of Basic Sciences. Sungshin Choi, Dennis Leveson en Rebecca Klotz hebben aanzienlijk bijgedragen aan het succes van onze ruimtevluchtstudie en we waarderen hun steun enorm. De auteurs willen ook de hele NASA Biospecimen Sharing Program groep bedanken voor hun grote hulp.
De auteurs willen ook het Center for Dental Research bedanken voor micro-CT service.
Materials
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
Referencias
- Dawson, L. The New Space Race. The Politics and Perils of Space Exploration. , 1-24 (2017).
- Mao, X. W., et al. Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue. Radiation Research. 180, 340-350 (2013).
- Overbey, E. G., et al. Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).
- Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes. Life. 4, 621-665 (2014).
- Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS). Eye. 32, 1164-1167 (2018).
- Stenger, M. B., et al. . Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).
- Garrett-Bakelman, F. E., et al. The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight. Science. 364, (2019).
- Mader, T. H., et al. Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight. Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).
- Mao, X. W., et al. Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations. Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).
- Silva, J. M. S., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Science Reports. 5, 14088 (2015).
- Descamps, E., et al. Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning. Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).
- Wu, J., Yin, N. Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography. Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).
- Roque-Torres, G. D. . Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , 139-170 (2020).
- Overbey, E. G., et al. Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina. Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).
- Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones. Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease. Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).
- Lee, A. G., et al. Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update. NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).
