使用微计算断层扫描（微CT）成像方法对太空飞行后全球眼结构进行评估

这项研究遵循了国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南中概述的建议，并经洛玛琳达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）和国家航空和航天局（美国航天局）批准。有关这次飞行实验的更详细的信息可以在,9，15的其他地方找到。9 1. 飞行和控制条件 注：2017年8月，SpaceX在肯尼迪航天中心（KSC）发射了第12次商业补给服务（CRS-12）有效载荷，执行为期35天的任务，其中包括在10周大的雄性C57BL/6小鼠（n = 20）上发射，用于美国宇航局的第九次罗登特研究实验（RR-9）。 在通过SpaceX的”龙”号太空舱返回地球之前，让老鼠在国际空间站上的NAS罗登栖息地（RH）中生存35天，环境温度为26~28°C，整个飞行周期为12小时。 将地面控制 （GC） 小鼠放入飞行中使用的相同外壳硬件中，并基于遥测数据尽可能匹配温度和二氧化碳 （CO2）水平等环境参数。 给GC老鼠喂食与太空老鼠相同的NASA食物吧饮食。为太空飞行和GC小鼠提供相同的水和食物。 2. 小鼠的飞行后评估 在地球上飞溅的28小时内，将老鼠运送到洛玛琳达大学（LLU）。一旦到达那里，从动物外壳硬件中删除小鼠，并评估生存和健康。注：经观察，检查人员报告说，所有小鼠都经受了35天的太空任务，状况良好，即无明显缺陷/异常。 3. 太空飞行后对老鼠眼睛进行解剖和保存 在飞溅（±4）小时内（n=20/组），在100%CO2 中对小鼠实施安乐死并采集它们的眼睛。 解剖右眼视网膜，单独放置在无菌冷冻液中，在液氮中捕捉冻结，并在使用前保持+80°C。 将整个左眼在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中固定为 4% 的对甲醛 24 小时，然后用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗，进行微 CT 测定。 4. 微CT扫描的样品制备 固定后，用乙醇脱水老鼠的眼睛。要保持固定样品的进一步或突然收缩，请使用分级的乙醇溶液：从 50% 乙醇开始 1 小时，然后增加乙醇溶液的浓度，如下所示 1 小时：70、80、90、96 和 100%。注：小鼠的眼睛必须在机罩室中处理。 磷酸酸 （PMA） 染色注意：由于PMA具有腐蚀性、致癌和对器官有毒，因此需要适当的防护个人设备，包括使用烟罩。 准备染色溶液：100 mL绝对乙醇中10毫克PMA。 染色小鼠的眼睛（10 wt. 磷酸酸 – PMA溶解在绝对乙醇中）6天。 在扫描之前，首先用绝对乙醇清洗眼睛样本，然后将每只眼睛放在单独的 2 mL 塑料容器中，这些塑料容器中填充了 100% 绝对乙醇。在扫描过程中添加棉垫以稳定样品。 5. 微CT扫描和分析 注：SkyScan 1272扫描仪是一种桌面X射线微型CT系统，用于评估小鼠眼睛的视网膜损伤 将软组织样品安装到适当的样品支架上。为防止在 X 射线 CT 测量过程中发生任何移动，请确保样品紧贴其支架上（图 1）。 对每个样品进行细致的校准后，通过 X 射线单独扫描样品。 打开软件后，将样品居中框架中。在协议中，不使用滤镜，并设置矩阵以将像素增加为 4 μm。使用微定位使样品居中在框架上。 之后，检查参数以最大化对比剂。要执行校准，请取出样品并检查平场校正是否大于 80%。 校准后，将样品重新插入扫描室。对于扫描，使用 0.400 的旋转步进，平均帧 4，随机运动 30，并旋转样本 180°。 使用定位夹具进行重复测量。由于按所述执行相位对比度增强，从 50 keV 和 80 mA 的密封微焦 X 射线管（钨阳极）生成的 X 射线中可以检测到小至 4 μm 的物体细节，集成时间为 90 分钟。注：本节中为选择而设置的采集参数，以生成具有最高图像质量的 CT 扫描概览。 扫描后，使用软件（例如 NRecon）重建数据。 调整直方图，并使用相同的范围 （0 = 0.24） 所有样本。重建感兴趣的区域是一个圆圈，没有使用比例或标签。 要减少扫描期间的伪影，请使用 20 的光束硬化校正，平滑校正 1，环伪影减少 6，并且不改变不对齐补偿。重建后，确认样品属于感兴趣的区域。 使用平行于眼睛的视神经和透镜的平面重新定位图像。 扫描后，使用软件（例如 DataViewer）在所有三个视图中可视化重建的图像。注：如有必要，使用该软件，可以使用与眼睛的视神经和透镜平行的平面对图像进行重新定位，以执行标准化分析。 描述性分析 使用软件中的测量工具（例如 CTAn）测量结构。使用光学神经来划定感兴趣的区域进行分析。通过计算，协议使用中间切片执行测量。此评估通过描述性分析（图 2 和 图 3） 执行。 测量下垂（图2）和轴向视图（图3）中的视网膜、视网膜色素上皮（RPE）、胆管和鼻塞层。对每个结构进行三次测量，以计算平均值。