Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Bu makalede bildirilen fareler üzerinde yapılan tüm araştırmalar SDSU Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır ve Ulusal Araştırma Konseyi tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu’na uygundur. 1. İzolasyon ve kültür medyasının hazırlanması ve kaplama 1 L steril suya Joklik modifiye minimum esansiyel ortam (MMEM) ekleyerek kullanmadan önce 1 L kalp perfüzyon ortamı hazırlayın. 10 N NaOH ile pH’ı 7,36’ya ayarlayın, ardından 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C’de saklayın.NOT: Joklik MMEM 112 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 9 mM NaH2PO4ve 11.1 mM D-glikozdan oluşur. Bu, 10 mM HEPES (2,38 g/L), 30 mM taurin (3,75 g/L), 2 mM D-l-karnitin (0,4 g/L), 2 mM kreatin ve 10 mM butanedione monoksim (1,01 g/L) ile desteklenmiştir. Perfüzyondan hemen önce sindirim tamponunu hazırlayın, aşağıdaki gibi: 100 mM CaCl 2’nin 6,25 μL’si (bkz. adım1,3) ve kollajenaz tip 2 (enzymatic aktivite ~310–320 U/mg dw) ile 50 mL kalp perfüzyon ortamı takviyesi.NOT: Kurban etmeden önce hayvanı tartın. Sindirim tamponuna takviye edilen kollajenaz tip 2 miktarı, hayvanın ağırlığı tarafından belirlenir (1 g vücut ağırlığı başına 2,25 mg kollajenaz tip 2). Hazırlamak için 100 mM CaCl2, 1.47 g CaCl2 ila 100 mL moleküler biyoloji sınıfı su ekleyin. Çözünene kadar karıştırın, ardından 0,2 μm’lik bir filtreden geçirin ve oda sıcaklığında 2 aya kadar saklayın. 90 mL kalp perfüzyon tamponunu 10 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 125 μL 100 mM CaCl 2 ile destekleyerek miyosit durdurmatamponu1’i hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C’de saklayın. 6 mL FBS ve 150 μL 10 mM CaCl 2 ile 114 mL kalp perfüzyon tamponunu destekleyerek miyosit durdurmatamponu 2’yihazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C’de saklayın. Dulbecco’nun modifiye Kartal ortamının (DMEM) 95 mL’sini 4 mL FBS, 1 mL’si 100x kalem/strep-glutamin, 1 mL’si 100x insülin transferin-selenyum ve 1 mL’si 10 μM deksametazon ile destekleyerek perfüzyondan hemen önce atriyal miyosit kaplama ortamını hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve kaplamaya kadar 37 °C’de saklayın. 4 mL FBS, 1 mL 100x kalem/strep-glutamin, 10 mL 1 M HEPES çözeltisi, 1 mL 100x insülin transferin-selenyum ve 0,1 g butanedione monoksim ile 95 mL minimum esansiyel ortamı (MEM) destekleyerek ventriküler miyosit kaplama ortamını hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C’de saklayın. 1 mL 100x insülin transferin-selenyum, 0,1 mg/mL sığır serum albümini (BSA), 10 mL 1 M HEPES çözeltisi ve 1 mL 100x kalem/strep-glutamin ile 99 mL MEM takviyesi yaparak ventriküler miyosit tutma ortamını hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C’de saklayın. Laminin kaplı deneysel plakalar ve slaytlar hazırlamak için fare laminin stok çözeltisini (1,19 mg/mL) çözün. Her 1 mL DMEM’e 10 μL laminin stok çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Deneysel plakaları ve slaytları eşit şekilde kaplayın ve dengeye izin vermek için perfüzyondan önce en az 1 saat boyunca 37 °C, %5 CO2 inkübatörde saklayın.NOT: Kaplamalı deneysel plakalar ve kaydıraklar 4 °C’de 2 güne kadar saklanabilir. 2. İzolasyon aparatı Her izolasyondan önce, kabarcık tuzağını üste doldurarak boruyu ve sistemin diğer bileşenlerini% 70 EtOH’luk üç tam yıkama ile temizleyin (alt stopcock’u kapatın ve üst stopcock’u açık tutun). Kabarcık tuzağını üste doldurarak tüm sistemi 3x steril H2O ile durulayın (alt stopcock’u kapatın ve üst stopcock’u açık tutun). Tüm sistemi kalp perfüzyon tamponu ile durulayın ve kabarcık tuzağını yarı yolda medya ile doldurun. Sirkülasyon suyu banyoyu 37 °C’ye ayarlayın. Ortam için bir su banyosayı 37 °C olarak ayarlayın. Peristaltik pompa borularındaki hava kabarcıklarını çıkarın. Peristaltik pompanın debisini 3 mL/dk olarak ayarlayın. 3. Cerrahi prosedür (sağkalım dışı) Cerrahi aletleri % 70 EtOH’da en az 5 dakika bekletin. Kalp perfüzyon medyasını, miyosit durdurma tamponlarını ve sindirim tamponunu 37 °C su banyosuna yerleştirin. Atriyal miyosit kaplama ortasını, ventrikül miyosit kaplama ortasını ve ventrikül miyosit bakım ortamını kullanmadan önce 37 °C, %5 CO2 inkübatör 1 saat içine yerleştirin ve dengeyi sağlamak için kapakları gevşetin. 10 haftalık erkek veya dişi C57b6/j farelere intraperitoneally (i.p.) ile 0.35 mL heparin enjekte edin, fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilerek 100 IU/mL’ye. İlacın yaklaşık 10 dakika boyunca etkili olmasını izin verin.NOT: İki kalp bu izolasyon işlemine tabi tutulacaksa, ikinci fare ilk işlemde bu noktada uyuşturulabilir ve heparin uygulanabilir. Hayvan üzerindeki stresi en aza indirmek için, hermetik olarak kapatılmış bir indüksiyon odasında% 2 izofluran / oksijen karışımı kullanılarak hafif anestezi uygulanabilir. Hayvanı% 2 izofluran / oksijen karışımı ile uyuşturun ve i.p.’ye pentobarbital (10 mg / mL stoktan 0.3 mL) enjekte edin, ardından% 70 EtOH ile sürünerek göğsü hazırlayın. Kalbi perfüzyon kanülüne bağlamaya hazır olmak için bağlı bir 5-0 ipek dikiş hazırlayın. Cerrahi mikroskobun hemen yanına canül monte edin. Önce karın ortasından çeneye kadar orta çizgi cilt kesisi yaparak, daha sonra büyük makasla peritona girerek, diyaframı künt diseksiyonla temizleyerek göğsü hızla açın. Daha sonra, her iki tarafın yan yönünde göğüs duvarını keserek makası kullanarak göğüs kafesini kesin. Kalp ve göğüs duvarı (timus dahil) arasındaki lifli bağlantıları kesin. Sonra göğüs kafesini hep birlikte kesin. Küçük tokmaları ve makası kullanarak, kalbi apeks tarafından hafifçe kaldırın ve kalbin arka yönünü ortaya çıkarın. Yükselen aorttaki innominat arterden hemen daha düşük bir şekilde parçalayarak kalbi ayıklayın ve kalbi hemen buz gibi PBS veya soğuk kalp perfüzyon ortamına yerleştirin. Daha sonra, buz gibi kalp perfüzyon ortamlarında ekilen kalpten kalan dokuyu hızla parçalara ayrıştırarak yükselen aortu ortaya çıkardı.NOT: Anatomik bir dönüm noktası olarak kullanmak için kalbi timus bozulmadan çıkarmak faydalıdır. Mikro diseksiyonlu tokmalar ve makas kullanarak fazla doku aortunun etrafındaki alanı temizleyin. Aortu ince uçlu dikizler kullanarak canül üzerine yerleştirin ve 5-0 ipek dikişle sabitleyin.NOT: En iyi yerleşim genellikle aortun canül üzerinde yaklaşık 2 mm yukarı çıkmasıyla gerçekleşir. 4 dakika boyunca 3 mL / dak’lık bir akış hızında kalp perfüzyon ortamı ile kanüle kalbi perfüzyon. Daha sonra ortamı kalp perfüzyon medyasından 15,0−17,5 dk perfüzyon için sindirim tamponu olarak değiştirin (Şekil 1A).NOT: Koroner akış hızı büyük olasılıkla artacak ve etkili doku sindirimini (yani soluk, şişmiş kalp) gösterecektir. 5.4 adımında daha sonra kullanmak için perfüzyonun son dakikalarında 8 mL sindirim tampon akışı toplayın. Kalbi çanak kemiğinden çıkarın ve 60 mm’lik plastik bir kültür kabına yerleştirin. Fazla dokuyu (yani aort, damarlar) çıkarın ve mekanik ayırmaya hazırlanmak için kalbi 2,5 mL sindirim tamponu içine batırın.NOT: Bu noktada, atria parçalara ayrılırken, bir deneyci atriyal hücre izolasyon protokolünü, ikinci bir deneyci ise ventrikül hücre izolasyonu yapmalıdır. 4. Atriyal hücre izolasyonu ve kültürü Aryayı kalpten uzaklaştırın ve 30 mm’lik plastik bir kültür kabına yerleştirin. Mekanik ayırma için 0,75 mL sindirim tamponu içine batırın. Ventrikülleri 60 mm’lik tabakta tutun (adım 3.12) ve ayrı izolasyon yöntemlerini aynı anda gerçekleştirin (bölüm 5, Şekil 1B).NOT: Bu noktada, sol ve sağ taraftaki hücreleri izole etmek gerekirse, atria ve ventriküller daha fazla ayrılmaya tabi tutulabilir. Atria’yı kıymaya ve alay etmeye başlayın, başlangıçta ince uçlu cerrahi makasla ve ardından daha fazla kıyma için ince forsepslerle. Dokuyu karıştırmaktan kaçının ve kas liflerini hızla ayırmayın. Steril bir transfer pipet ucu kullanarak, dokuyu 15 dakika boyunca hafifçe karıştırmaya ve ayırmaya devam edin. Her 5 dakikada bir, 10x objektif brightfield mikroskobu altında dokudan atriyal miyosit disassosiyasyonunu gözlemleyin. Doku daha fazla sindirildikçe, daha küçük gözenek boyutuna sahip steril bir transfer pipet ucu kullanarak dokuyu hafifçe karıştırmaya ve ayırmaya devam edin. Hücre süspansiyonu 2 mL steril mikro santrifüj tüpüne aktarın. 30 mm’lik plakayı 37 °C miyosit durdurma tamponu 1’in 0,75 mL’si ile durulayın ve hücre süspansiyonuyla birleştirin (bitiş hacmi = 1,5 mL). Atriyal miyositlerin oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yerçekimi ile tortulanmasına izin verin. Miyositlerin konik tüpün dibine çökeltilmesine izin vermek için hücre süspansiyonunun hafifçe çalkalanması ve görünür bir pelet oluşturması. Hücre süspansiyonu 20 x g’da5 dakika santrifüj. Miyosit olmayanları içeren süpernatant’ı dikkatlice çıkarın ve atriyal miyositlerin peletini bozmadan steril bir pipet ucu kullanarak 15 mL polipropilen konik tüpe aktarın. Miyosit olmayan fraksiyonu 20.000 x g’da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatantı aspire ve miyosit olmayan peleti% 10 fetal baldır serumu (FCS) ile desteklenmiş 10 mL DMEM’de yeniden kullanın. Hemositometre veya başka bir yöntem kullanarak miyosit olmayanları sayın, ardından deneysel ihtiyaçlara göre plakalayın veya floresanla aktive edilmiş hücre sıralama yoluyla bireysel spesifik hücre popülasyonlarına daha fazla izole edin (Şekil 1C). İzole atriyal miyositlerin peletini atriyal miyosit kaplama ortamının 1 mL’sinde 4,6 adımdan yeniden uygulayın ve bu süspansiyonun 10 μL’lik kısmını bir hemositometreye uygulayın. Alan başına çubuk şeklindeki miyositlerin hücre sayısını gerçekleştirin. Önceden kaplanmış deneysel plakalardan/slaytlardan laminin aspiratlayın ve izole edilmiş atriyal miyositleri 25 μM blebbistatin ile desteklenmiş uygun atriyal miyosit kaplama ortamı hacminde yeniden kullanın. Deneysel ihtiyaçlar başına istenen yoğunlukta plaka (Şekil 1C).NOT: Burada açıklanan uzun süreli kültleme için tipik kaplama yoğunluğu, dört odalı (1,7 cm2)cam slaytlar üzerinde 5 x 105 hücre /odadır. 5. Ventrikül hücre izolasyonu ve kültürü Önce ince uçlu cerrahi makas ve ardından daha fazla kıyma için ince forseps ile kalbi ventrikül dokusunu kıymaya ve alay etmeye başlayın (Şekil 1B). Kas liflerini hızla ayırarak dokuyu tedirgin etmekten kaçının. Hücre süspansiyonunu 15 mL polipropilen konik tüpe aktarın. Plakayı 2,5 mL 37 °C miyosit durdurma tamponu 1 ile durulayın ve hücre süspansiyonu ile birleştirin (bitiş hacmi = 5 mL). Steril bir transfer pipet ucu kullanarak, dokuyu 4 dakika boyunca hafifçe karıştırmaya ve ayırmaya devam edin. Bu hücre süspansiyonunun 10 μL’lik kısmını slayda uygulayın ve izolasyon kalitesini sağlamak için çubuk şeklindeki miyositlerin varlığını görselleştirin. Hücre süspansiyonunu 100 μm steril naylon filtreden 50 mL polipropilen konik bir tüpe geçirin. Kalan hücreleri steril naylon filtreden yıkamak için 3.12 adımında toplanan 2 mL sindirim tamponunu kullanın. Ventrikül miyositlerinin oda sıcaklığında 6 dakika boyunca yerçekimi ile tortulanmasına izin verin. Miyositlerin konisinin dibinde çökeltilmesine izin vermek için filtrelenmiş hücre süspansiyonu hafifçe çalkalayın ve görünür bir pelet oluşturun. Ventriküler miyositlerin peletini bozmadan, süpernatantları (miyosit olmayan) dikkatlice çıkarın ve steril bir pipet ucu kullanarak 50 mL polipropilen konik bir tüpe aktarın. Miyosit olmayan fraksiyonu 20.000 x g’da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve miyosit olmayan peleti% 10 FCS ile desteklenmiş 10 mL DMEM’de yeniden kullanın. Hemositometre kullanarak miyosit olmayanları sayın ve FCS ile desteklenmiş uygun bir DMEM hacminde yeniden kullanın. Daha sonra, deneysel ihtiyaçlara göre plakalayın veya floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama yoluyla bireysel spesifik hücre popülasyonlarına daha fazla izole edin (Şekil 1C). İzole ventrikül miyositlerini 2 mL miyosit durdurma tamponu 2’ye yeniden uygulayın ve hemositometreye 10 μL hücre süspansiyonu uygulayın. Alan başına çubuk şeklindeki miyositlerin hücre sayısını gerçekleştirin. Ca2+’nın adım adım bir paradigma kullanılarak yeniden tanıtılmasıNOT: Kalsiyum reintrodüksiyon adımları ventriküler miyositler için özeldir ve hücre ölümü ile sonuçlanacağı için atriyal miyositler için yapılmamalıdır. Ventrikül miyosit hücre süspansiyonu için 50 μL 10 mM CaCl2 ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkaya yatır. Ventrikül miyosit hücre süspansiyonu için 10 mM CaCl2’lik ek 50 μL ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkaya yatır. Ventrikül miyosit hücre süspansiyonu için 100 μL 10 mM CaCl2 daha ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkaya yatır. Ventrikül miyosit hücre süspansiyonu için 80 μL 100 mM CaCl2 ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkaya yatır. Laminin kaplamayı plakalardan veya slaytlardan çıkarın ve izole edilmiş ventrikül miyositlerini deneysel ihtiyaçlara göre uygun bir ventriküler miyosit kaplama ortamı hacminde yeniden kullanın (Şekil 1C).NOT: Burada açıklanan uzun süreli kültleme için tipik kaplama yoğunluğu, dört odalı (1,7 cm2)cam slaytlar üzerinde 5 x 105 hücre /odadır. Hücresel aşırı densifikasyon hücre topaklanmasını teşvik ettiği ve böylece plakaya bağlanmayı engellediği için% 75’ten fazla izdiah yoğunluğunda kaplamadan kaçının. Ayrıca, ilk orta değişim sırasında çok sayıda hücre kaybolacaktır. Hücre dışı Ca2+, hiperkretsiyonu ve canlı miyositlerin kaybını teşvik ettiği için izolasyondan sonra hızlı bir şekilde plaka hücreleri. Ventriküler miyositlerin en az 1 saat boyunca yerleşmesine ve yapışmasına izin verin. Daha sonra ortamı 25 μM blebbistatin ile desteklenmiş ventrikül miyosit bakım ortamına değiştirin.NOT: Ventriküler miyositler μM blebbistatin ile kaplattıktan sonra 96 saate kadar kültürlenebilir. Deneyler, blebbistatin yokluğunda ventriküler miyosit tutma ortamında yapılmalıdır.