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Biología

Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

Published: June 14, 2020
doi:
10.3791/61224
, , , ,
1San Diego State University Heart Institute and the Department of Biology,San Diego State University

Summary

Eine Methode wird beschrieben, um Myozyten und Nicht-Myozyten gleichzeitig von den Vorhöfen und Ventrikeln eines einzelnen erwachsenen Mausherzens zu isolieren. Dieses Protokoll führt zu konsistenten Erträgen von hochlebensfähigen Herzmyozyten und Nicht-Myozyten und beschreibt optimale zellspezifische Kulturbedingungen für Phänotypisierung und In-vitro-Analyse.

Abstract

Die Isolierung und Kultivierung von Herzmyozyten von Mäusen war wesentlich für die Förderung des Verständnisses der Herzphysiologie und Pathophysiologie. Während die Isolierung von Myozyten aus neonatalen Mausherzen relativ einfach ist, werden Myozyten aus dem erwachsenen murinen Herzen bevorzugt. Dies liegt daran, im Vergleich zu neonatalen Zellen, erwachsene Myozyten genauer rekapitulieren Zellfunktion, wie es im erwachsenen Herzen in vivoauftritt. Es ist jedoch technisch schwierig, adulte Herzmyozyten in den notwendigen Mengen und Lebensfähigkeit zu isolieren, was zu einer experimentellen Sackgasse beiträgt. Darüber hinaus sind veröffentlichte Verfahren spezifisch für die Isolierung von vorgerichtlichen oder ventrikulären Myozyten auf Kosten von Vorhof- und ventrikulären Nicht-Myozytenzellen. Hier wird eine detaillierte Methode zur Isolierung von vorgerichtlichen und ventrikulären Herzmyozyten, zusammen mit vorbläfernen und ventrikulären Nicht-Myozyten, gleichzeitig von einem einzigen Mausherz beschrieben. Ebenfalls zur Verfügung gestellt werden die Details für optimale zellspezifische Kultivierungsmethoden, die die Zelllebensfähigkeit und -funktion verbessern. Dieses Protokoll zielt nicht nur darauf ab, den Prozess der Isolierung von erwachsenen murinen Herzzellen zu beschleunigen, sondern auch die Ausbeute und Lebensfähigkeit von Zellen für Untersuchungen von atrialen und ventrikulären Herzzellen zu erhöhen.

Introduction

Primäre Zellkultur ist eine integrale Ressource, die eine kontrollierte Umgebung für detaillierte mechanistische Studien der herzmyozyten Funktion bietet. Aufgrund ihrer haltbareren Natur und der einfachen Isolation waren neonatale Rattenvorhof und ventrikuläre Myozyten die häufige Quelle solcher Zellkulturen1. Erwachsene Maus-Vorhof und ventrikuläre Myozyten (AMAMs und AMVMs) sind jedoch sehr wünschenswert für In-vitro-Studien, da ihre molekularen und funktionellen Eigenschaften besser die von erwachsenen Herzzellen imitieren. So sind sie relevant geworden für Studien im Zusammenhang mit Herzpathologien, von denen die meisten bei Erwachsenen entwickeln2.

Darüber hinaus erweitert die Verfügbarkeit und Verwendung von transgenen und Krankheitsmausmodellen den Nutzen isolierter erwachsener Herzmyozyten. Protokolle für die Isolierung und Kultur von Maus AMVMs für Kurz- und Langzeitstudien wurden in zahlreichen früheren Publikationen2,3,4,5,6,7,8,9,10,11beschrieben. Im Vergleich dazu wurden nur wenige Protokolle für die Isolierung von AMAMs beschrieben. Darüber hinaus sind die beschriebenen personen in erster Linie für akute Studien an frisch isolierten Zellen optimiert, ohne dass bisher ein Langzeit-Kultivierungsprotokoll beschrieben wurde11,12,13. Daher wurden AMAM-Isolationsprotokolle nicht entwickelt, um die Nützlichkeit und Vielseitigkeit veröffentlichter Protokolle für die Isolierung und Kultur von AMVMs bereitzustellen. Darüber hinaus haben sich die wegweisenden Studien zur Isolierung von AMAMs und AMVMs als einfallsreich erwiesen, aber es gibt keine Protokolle für eine optimale gleichzeitige Isolierung und Kultur von AMAMs und AMVMs, was zu einer effizienten Nutzung des gesamten Herzens für jede Zubereitung führt.

Bisher wurden veröffentlichte AMAM- und AMVM-Isolationsprotokolle nicht für die gleichzeitige Isolierung beider Zelltypen entwickelt, da die meisten Studien über Atrial- und Ventrikuläre Funktion einen kammerspezifischen Fokus haben. Zum Beispiel werden AMAMs vorwiegend zur Untersuchung der Vorhofflzytenelektrophysiologie eingesetzt, teilweise wegen des Interesses an Vorhofflimmern (AF), der häufigsten Herzrhythmusstörung in den USA. Jedoch, AF ist keine Krankheit, die die Vorhöfe isoliert betrifft, und es wurde als eine ursächliche Rolle bei leichten bis schweren linksventrikulären Dysfunktion14beteiligt. Darüber hinaus haben Elektrokardiogramme von Patienten mit Herzinsuffizienz mit konservierter Auswurffraktion (HFpEF) gezeigt, dass die linke Vorhofgröße einer der stärksten Prädiktoren für die Anfälligkeit für Herzinsuffizienzist 15.

Neben seiner Rolle in der Elektrophysiologie und Kontraktilität ist das Atrium auch ein endokrines Organ, das Kardiokine (d.h. vorhoffnales natriuretisches Peptid [ANP]) absondert, das den Blutdruck und das Volumen16,17homöostisch reguliert. Darüber hinaus hat ANP (vermutlich aus vorhofflenden Myozyten) eine prominente schützende und antihypertrophe Rolle bei ventrikulären Myozyten16,17. Zwar gibt es eine starke Implikation der neurohormonalen Kommunikation zwischen Vorhöfen und Ventrikeln in verschiedenen Krankheitszuständen, die Mechanismen, die dieser Kommunikation zugrunde liegen, wurden nicht vollständig erforscht. Dieser Punkt wird durch den Anstieg der Forschung, der sich auf 1) die Rolle von Nicht-Myozyten (insbesondere Herz-Fibroblasten und Immunzellen) im erkrankten Herzen und 2) wie herzische Umgestaltung als Funktion der Krankheit direkt beeinflusst Herzmyozyten Lebensfähigkeit und globale Herzfunktion18,19,20,21,22. Daher ist die Untersuchung von Herzzellen aus Vorhöfen und Ventrikeln ein notwendiger Ansatz, um ein vollständigeres Bild ihrer Rolle in der Karditophysiologie zu erhalten.

Das folgende Protokoll beschreibt die gleichzeitige Isolierung von vorgerichtlichen und ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem einzigen Mausherz unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen. Darüber hinaus ist diese Methode die erste, die optimale Bedingungen beschreibt, die für die Erhaltung von Kulturen von vorgerichtlichen Herzmyozyten notwendig sind, da die Bedingungen für die Erhaltung von Kulturen ventrikulärer Myozyten bereits veröffentlicht wurden.

Protocol

Alle in diesem Papier veröffentlichten Forschungsarbeiten an Mäusen wurden vom SDSU Institutional Animal Care and Use Committee überprüft und genehmigt und entsprechen dem vom National Research Council veröffentlichten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Vorbereitung von Isolations- und Kulturmedien und Beschichtungen Bereiten Sie 1 L Herzperfusionsmedium vor der Verwendung vor, indem Sie Joklik modifizierte minimale essentielle Medien (MMEM) zu 1 L sterilem Wasser hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 N NaOH auf 7,36 ein, filtern Sie dann durch einen 0,2 m Filter und lagern Sie ihn bis zu 2 Wochen bei 4 °C.HINWEIS: Joklik MMEM besteht aus 112 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2,9 mM NaH2PO4und 11,1 mMM D-Glucose. Ergänzt wird dies durch 10 mM HEPES (2,38 g/L), 30 mM Taurin (3,75 g/L), 2 mM D-l-Carnitin (0,4 g/L), 2 mM Kreatin und 10 mM Butandionmonoxim (1,01 g/L). Bereiten Sie den Verdauungspuffer kurz vor der Perfusion wie folgt vor: Ergänzung 50 ml Herzperfusionsmedium mit 6,25 l von 100 mM CaCl2 (siehe Schritt 1.3) und Kollagenase Typ 2 (enzymatische Aktivität 310–320 U/mg dw).HINWEIS: Wiegen Sie das Tier vor dem Opfer. Die Menge der Kollagenase Typ 2, die in den Verdauungspuffer eingebracht wird, wird durch das Gewicht des Tieres bestimmt (2,25 mg Kollagenase Typ 2 pro 1 g Körpergewicht). Zur Vorbereitung von 100 mM CaCl21,47 g CaCl2 bis 100 ml molekularbiologisches Wasser hinzufügen. Rühren, bis sie gelöst sind, dann durch einen 0,2 m Filter passieren und bei Raumtemperatur bis zu 2 Monate lagern. Bereiten Sie Myozyten-Stopppuffer 1 vor, indem Sie 90 ml Herzperfusionspuffer mit 10 ml fetalem Rinderserum (FBS) und 125 l von 100 mM CaCl2ergänzen. Durcheinen Sie einen 0,2-mm-Filter passieren und bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern. Bereiten Sie Myozyten-Stopppuffer 2 vor, indem Sie 114 ml Herzperfusionspuffer mit 6 ml FBS und 150 l von 10 mM CaCl2ergänzen. Durcheinen Sie einen 0,2-mm-Filter passieren und bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern. Bereiten Sie die Vorhofflmirsmyozytenbeschichtung kurz vor der Perfusion vor, indem Sie 95 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco mit 4 ml FBS, 1 ml 100x Pen/Strep-Glutamin, 1 ml 100x Insulin-Transferrin-Selen iumund 1 ml 10 mD-Dexamethason ergänzen. Durcheinen Sie einen 0,2-mm-Filter passieren und bei 37 °C bis zur Beschichtung lagern. Bereiten Sie ventrikuläre Myozytenbeschichtungsmedium durch Ergänzung 95 ml des minimalen essentiellen Mediums (MEM) mit 4 ml FBS, 1 ml 100x Pen/Strep-Glutamin, 10 ml 1 M HEPES-Lösung, 1 ml Insulin-Transferrin-Selen und 0,1 g Butandion-Monoxim vor. Durcheinen Sie einen 0,2-mm-Filter passieren und bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern. Bereiten Sie ventrikuläre Myozytenerhaltungsmedium vor, indem Sie 99 ml MEM mit 1 ml 100x Insulin-Transferrin-Selen, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 10 ml 1 M HEPES-Lösung und 1 ml 100x Pen/Strep-Glutamin ergänzen. Durcheinen Sie einen 0,2-mm-Filter passieren und bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern. Zur Herstellung von lamininbeschichteten Versuchsplatten und Dias, tauen Mauslaminin-Stammlösung (1,19 mg/ml). Fügen Sie jedem 1 ml DMEM 10 L Laminin-Lagerlösung hinzu und mischen Sie sie. Beschichten Sie Versuchsplatten und Dias gleichmäßig und lagern Sie in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator für mindestens 1 h vor der Perfusion, um einen Ausgleich zu ermöglichen.HINWEIS: Beschichtete Versuchsplatten und Dias können bis zu 2 Tage bei 4 °C gelagert werden. 2. Isolationsapparat Reinigen Sie vor jeder Isolierung die Schläuche und andere Komponenten des Systems mit drei kompletten Waschungen von 70% EtOH, indem Sie die Blasenfalle nach oben füllen (den unteren Hahn schließen und den oberen Stopcock offen halten). Spülen Sie das komplette System 3x mit sterilem H2O, indem Sie die Blasenfalle nach oben füllen (den unteren Hahn schließen und den oberen Stopcock offen halten). Spülen Sie das komplette System mit Herzperfusionspuffer aus und füllen Sie die Blasenfalle auf halbem Weg mit Medien. Stellen Sie das zirkulierende Wasserbad auf 37 °C ein. Stellen Sie ein Wasserbad für Medien auf 37 °C ein. Entfernen Sie alle Luftblasen in den peristaltischen Pumpenschläuchen. Stellen Sie den Durchfluss der Peristaltikpumpe auf 3 ml/min ein. 3. Chirurgischer Eingriff (Nicht-Überleben) Chirurgische Instrumente in 70% EtOH für mindestens 5 min einweichen. Legen Sie das Herzperfusionsmedium, Myozytenstopppuffer und Denkpuffer in das 37 °C-Wasserbad. Legen Sie das vorgericht liegende Myozytenbeschichtungsmedium, das ventrikuläre Myozytenbeschichtungsmedium und das ventrikuläre Myozyten-Erhaltungsmedium in ein 37 °C, 5% CO2-Inkubator 1 h vor Gebrauch und lösen Sie die Kappen, um eine Gleichgewichtslösung zu ermöglichen. 10 Wochen alte männliche oder weibliche C57b6/j-Mäuse intraperitoneal (i.p.) mit 0,35 ml Heparin injizieren, in Phosphat gepufferter Kochsaline (PBS) auf 100 I.E./ml verdünnt. Lassen Sie das Medikament für ca. 10 min wirksam werden.HINWEIS: Wenn zwei Herzen diesem Isolationsverfahren unterzogen werden sollen, kann die zweite Maus an dieser Stelle des ersten Verfahrens beästhetisiert und Heparin verabreicht werden. Um die Belastung des Tieres zu minimieren, kann eine leichte Anästhesie mit 2% Isofluran/Sauerstoffgemisch in einer hermetisch abgedichteten Induktionskammer verabreicht werden. Anästhetisieren Sie das Tier mit einem 2% Isofluran/Sauerstoff-Gemisch und injizieren i.p. mit Pentobarbital (0,3 ml von 10 mg/ml Vorrat), dann bereiten Sie die Brust durch Abwischen mit 70% EtOH. Bereiten Sie eine gebundene 5-0 Seidennaht vor, um bereit zu sein, das Herz an die Perfusionskanüle zu binden. Montieren Sie Kanüle direkt neben dem chirurgischen Mikroskop. Öffnen Sie schnell die Brust, indem Sie zuerst einen Mittellinien-Hautschnitt machen, vom Mittelbauch bis zum Kiefer, dann mit der großen Schere in das Peritoneum eindringen und das Zwerchfell durch stumpfe Zerlegung entfernen. Dann schneiden Sie den Rippenkäfig mit der Schere mit Schnitten der Brustwand auf dem seitlichen Aspekt beider Seiten. Schneiden Sie faserige Verbindungen zwischen Herz und Brustwand (einschließlich Thymus) weg. Dann schneiden Sie den Rippenkäfig alle zusammen. Heben Sie das Herz mit den kleinen Zangen und der Schere sanft an der Spitze an und legen Sie den hinteren Aspekt des Herzens frei. Expflanzen Sie das Herz, indem Sie sofort schlechter als die innomische Arterie auf der aufsteigenden Aorta und legen Sie das Herz sofort in eiskalte PBS oder kalte Herzperfusionsmedien. Anschließend, schnell dissektect weg restliches Gewebe aus dem explantierten Herzen in eiskalten Herz Perfusion Medien, die aufsteigende Aorta aussetzen.HINWEIS: Es ist nützlich, das Herz mit dem intakten Thymus zu expflanzen, um es als anatomisches Wahrzeichen zu verwenden. Reinigen Sie den Bereich um die Aorta von überschüssigem Gewebe mit mikrosezierenden Zangen und Scheren. Positionieren Sie die Aorta mit feingekippten Zangen auf die Kanüle und sichern Sie sie mit einer 5-0 Seidennaht.HINWEIS: Die beste Platzierung findet sich in der Regel mit der Aorta, die sich etwa 2 mm auf der Kanüle erstreckt. Durchdringen Sie das kanülierte Herz mit Herzperfusionsmedien mit einer Durchflussrate von 3 ml/min für 4 min. Wechseln Sie dann das Medium von Herzperfusionsmedien auf Verdauungspuffer für 15,0 bis 17,5 min Perfusion (Abbildung 1A).HINWEIS: Die koronare Durchflussrate wird wahrscheinlich zunehmen, was auf eine effektive Gewebeverdauung (d. h. blasses, geschwollenes Herz) hindeutet. Sammeln Sie 8 ml Verdauungspufferdurchfluss während der letzten Minuten der Perfusion für die spätere Verwendung in Schritt 5.4. Entfernen Sie das Herz aus der Kanüle und legen Sie es auf eine 60 mm Kunststoffkulturschale. Überschüssiges Gewebe (d. h. Aorta, Venen) entfernen und das Herz in 2,5 ml Verdauungspuffer als Vorbereitung auf die mechanische Trennung untertauchen.HINWEIS: An dieser Stelle werden die Vorhöfe entfernt, und ein Experimentator sollte das Vorhofzellisolationsprotokoll durchführen, während ein zweiter Experimentator die ventrikuläre Zellisolierung durchführen sollte. 4. Vorhofzellisolation und -kultur Sezieren Sie die Vorhöfe vom Herzen weg und legen Sie sie in eine 30 mm Plastikkulturschale. Tauchen Sie es in 0,75 ml Verdauungspuffer für die mechanische Trennung. Bewahren Sie die Ventrikel in der 60 mm Schale (Schritt 3.12) auf und führen Sie die getrennten Isolationsmethoden gleichzeitig durch (Abschnitt 5, Abbildung 1B).HINWEIS: An dieser Stelle können die Vorhöfe und Ventrikel weiter getrennt werden, wenn die links- und rechten Zellen isoliert werden müssen. Beginnen Sie, die Vorhöfe auseinander zu hacken und zu necken, zunächst mit einer feinspitzen chirurgischen Schere und gefolgt von feinen Zangen für weitere Schnitte. Vermeiden Sie das Gewebe zu rühren, und ziehen Sie nicht schnell Muskelfasern auseinander. Mit einer sterilen Transferpipettenspitze das Gewebe 15 min lang sanft mischen und trennen. Alle 5 min beobachten Sie die Vorhofflinz-Myozyten-Disassoziation vom Gewebe unter einem 10-fachobjektiven Hellfeldmikroskop. Wenn das Gewebe weiter verdaut wird, mischen und dissoziieren Sie das Gewebe mit einer sterilen Transferpipettenspitze mit einer kleineren Porengröße. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 2 ml steriles Mikrozentrifugenrohr. Spülen Sie die 30-mm-Platte mit 0,75 ml 37 °C Myozyten-Stopppuffer 1 und kombinieren Sie mit der Zellsuspension (Endvolumen = 1,5 ml). Lassen Sie die vorgerichtliegenden Myozyten durch Schwerkraft für 10 min bei Raumtemperatur sedimentieren. Rühren Sie die Zellsuspension sanft auf, damit Myozyten bis zum Boden des konischen Rohres sedimentieren und ein sichtbares Pellet bilden. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 20 x g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, der die Nicht-Myozyten enthält, und übertragen Sie ihn mit einer sterilen Pipettenspitze in ein 15 ml Polypropylen-Konusrohr, ohne das Pellet von Vorhofmyozyten zu stören. Zentrifugieren Sie die Nicht-Myozyten-Fraktion für 5 min bei 20.000 x g. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Nicht-Myozyten-Pellet in 10 ml DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum (FCS), wieder aus. Zählen Sie Nicht-Myozyten mit einem Hämozytometer oder einer anderen Methode, dann Platte nach experimentellen Bedürfnissen, oder weiter in einzelne spezifische Zellpopulationen über Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung isolieren (Abbildung 1C). Setzen Sie das Pellet isolierter Vorhofmyozyten von Schritt 4,6 in 1 ml Vorhoffmyozytenbeschichtungsmedium aus und tragen Sie 10 l dieser Suspension auf ein Hämozytometer auf. Führen Sie eine Zellzahl von stabförmigen Myozyten pro Feld aus. Aspirieren Sie Laminin aus vorbeschichteten Versuchsplatten/Dias und setzen Sie die isolierten Vorhofmyozyten im entsprechenden Volumen des vorgerichtlichen Myozyten-Beschichtungsmediums, ergänzt mit 25 M Blebbistatin, wieder aus. Platte mit der gewünschten Dichte pro Versuchsbedarf (Abbildung 1C).HINWEIS: Typische Beschichtungsdichte für die hier beschriebene Langzeitkultivierung beträgt 5 x 105 Zellen/Kammer auf Vierkammer-Glasgweise (1,7 cm2). 5. Ventrikuläre Zellisolation und -kultur Beginnen Sie, Hackfleisch und necken Herz auseinander ventrikuläres Gewebe, zuerst mit feiner Spitze chirurgische Schere und gefolgt von feinen Zangen für weitere Hacken (Abbildung 1B). Vermeiden Sie das Gewebe zu agitieren, indem Sie schnell Muskelfasern auseinander ziehen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Polypropylen-Konusrohr. Spülen Sie die Platte mit 2,5 ml 37 °C Myozyten-Stopppuffer 1 und kombinieren Sie mit der Zellsuspension (Endvolumen = 5 ml). Mit einer sterilen Transferpipettenspitze, weiterhin sanft mischen und dissoziieren Sie das Gewebe für 4 min. Tragen Sie 10 L dieser Zellsuspension auf das Dia auf und visualisieren Sie das Vorhandensein von stabförmigen Myozyten, um die Isolationsqualität zu gewährleisten. Übergeben Sie die Zellsuspension durch einen 100 m sterilen Nylonfilter in ein 50 ml Polypropylen-Konrohr. Verwenden Sie 2 ml Verdauungspuffer, der in Schritt 3.12 gesammelt wurde, um alle verbleibenden Zellen vom sterilen Nylonfilter zu waschen. Lassen Sie die ventrikulären Myozyten durch Schwerkraft für 6 min bei Raumtemperatur sedimentieren. Rühren Sie die gefilterte Zellsuspension sanft, damit Myozyten am Boden des Konischen sedimentieren und ein sichtbares Pellet bilden. Ohne das Pellet ventrikulärer Myozyten zu stören, entfernen Sie vorsichtig den Überstand (Nicht-Myozyten) und übertragen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze auf ein 50 ml Polypropylen-Konusrohr. Zentrifugieren Sie die Nicht-Myozyten-Fraktion für 5 min bei 20.000 x g. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Nicht-Myozyten-Pellet in 10 ml DMEM, ergänzt mit 10% FCS, wieder aus. Zählen Sie Nicht-Myozyten mit einem Hämozytometer und resuspendieren Sie in einem entsprechenden Volumen von DMEM mit 10% FCS ergänzt. Dann Platte nach experimentellen Bedürfnissen, oder weiter in einzelne spezifische Zellpopulationen über Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung isolieren (Abbildung 1C). Setzen Sie die isolierten ventrikulären Myozyten in 2 ml Myozyten-Stopppuffer 2 wieder auf und tragen Sie 10 l Zellsuspension auf das Hämozytometer auf. Führen Sie eine Zellzahl von stabförmigen Myozyten pro Feld aus. Wiedereinführung von Ca2+ nach einem stufenweisen ParadigmaHINWEIS: Calcium-Wiedereinführungsschritte sind spezifisch für ventrikuläre Myozyten und sollten nicht für vorgerichtliche Myozyten durchgeführt werden, da dies zum Zelltod führen wird. Fügen Sie der ventrikulären Myozytenzellsuspension 50 l von 10 mM CaCl2 hinzu. Gut mischen und 4 min bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie der ventrikulären Myozytenzellsuspension eine zusätzliche Suspension von 50 l von 10 mM CaCl2 hinzu. Gut mischen und 4 min bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie der ventrikulären Myozytenzellsuspension eine zusätzliche Suspension von 100 l von 10 mM CaCl2 hinzu. Gut mischen und 4 min bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie der ventrikulären Myozytenzellsuspension 80 l von 100 mM CaCl2 hinzu. Gut mischen und 4 min bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Lamininbeschichtung von Platten oder Dias und setzen Sie die isolierten ventrikulären Myozyten in einem geeigneten Volumen ventrikulärer Myozytenbeschichtungsmediumentsprechend entsprechend den experimentellen Bedürfnissen wieder auf (Abbildung 1C).HINWEIS: Typische Beschichtungsdichte für die hier beschriebene Langzeitkultivierung beträgt 5 x 105 Zellen/Kammer auf Vierkammer-Glasgweise (1,7 cm2). Vermeiden Sie eine Beschichtung bei einer Dichte von mehr als 75 % Konfluenz, da die zelluläre Überdichteung die Zellverklumpung fördert und dadurch die Bindung an die Platte hemmt. Darüber hinaus gehen während der ersten mittleren Veränderung eine große Anzahl von Zellen verloren. Plattenzellen schnell nach der Isolierung, da extrazelluläre Ca2+ Hyperkontraktion und Verlust lebensfähiger Myozyten fördert. Lassen Sie die ventrikulären Myozyten sich niederlassen und für mindestens 1 h haften. Anschließend ändern Sie das Medium in ventrikuläre Myozytenpflege Medium ergänzt mit 25 M Blebbistatin.ANMERKUNG: Ventrikuläre Myozyten können nach der Beschichtung in ‘M blebbistatin bis zu 96 h kultiviert werden. Experimente sollten in ventrikuläre Myozyten-Erhaltungsmedium in Abwesenheit von Blebbistatin durchgeführt werden.

Representative Results

Ein 10 Wochen altes Mausherz C57b6/j führt in der Regel zu einer Gesamtmenge von 75.000 bis 150.000 Vorhoffnundmyozyten und 1,0 x 1,5 x 106 ventrikulären Myozyten, was einer ungefähren Ausbeute von 30 % bis 50 % für vorgerichtliche und ventrikuläre Myozyten18,19entspricht. Während und unmittelbar nach Isolierungen sollten lebensfähige Herzmyozyten stabförmig und nicht kontrahiert erscheinen. Die Mehrheit der isolierten Herzmyozyten sollte diese Morphologie anpassen, die ein Hinweis auf eine effektive Perfusion ist. Die Stabformmorphologie kann auch ein Prädiktor für die Lebensfähigkeit sein. Das Protokoll zielt darauf ab, die Ausbeute und Lebensfähigkeit von Myozyten und Nicht-Myozyten zu verbessern, die von einem kranken Mausherz isoliert sind. Darüber hinaus wurde es in einem Modell der drucküberlastinduzierten Herzinsuffizienz getestet (Daten nicht gezeigt). Um eine adäquate und reproduzierbare Isolierung von Myozyten und Nicht-Myozyten aus Vorhof- und Ventrikulärgewebe zu bestätigen, wurden Zellen beobachtet und an verschiedenen Tagen in kultur fotografiert (Abbildung 2). Zusätzlich wurde eine quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) durchgeführt, um die Konzentrationen von Transkripten zu messen, die zelltypspezifisch waren. Herzmuskeltroponin T (Tnnt2) ist ein Marker von Herzmyozyten und wurde robust in vorgerichtlichen und ventrikulären Herzmyozytenkulturen ausgedrückt (Abbildung 3A). Im Gegensatz dazu waren das vorhole natriuretische Peptid (Nppa, das typischerweise ausschließlich in erwachsenen vorgerichtlichen Herzmyozyten unter physiologischen Bedingungen exprimiert wird) und Myosin-Lichtkette 2 (Myl2, ein ventrikuläres Myozyten-spezifisches Gen) robust und spezifisch in vorhoffenden und ventrikulären Herzmyozytenkulturen bzw.(Abbildung 3B,C) ausgedrückt. Fibroblastenmarker, Transkriptionsfaktor 21 (Tcf21), Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktorrezeptor A (Pdgfra) und monozytenabgeleiteter Zellmarker-Cluster der Differenzierung 68 (Cd68) wurden ausschließlich in Nicht-Myozytenkulturen exprimiert, die sowohl aus Atrial- als auch aus ventrikulären Kammern isoliert wurden (Abbildung 3D-F). Es wird geschätzt, dass Nicht-Myozyten 65 % aller Herzzellen kompromittieren und dass die Mehrheit dieser Von ihnen aus einer Fibroblasten- oder Monozyten-abgeleiteten Abstammung18,19,23,24stammt. So wurden Marker für diese beiden Linien gewählt, um repräsentativ zu sein, angesichts des Interesses an diesen zellulären Populationen in Studien verschiedener Modelle und Ätiologien der Herzpathologie. Die Immunostainierung von AMAMs und AMVMs für den t-Tubule-Marker Dihydropyridin (DHPR, ein spannungsabhängiger (L)-Typ Calciumkanal) sowie des Ryanodinrezeptors (RYR2) zeigte intakte T-Tubulen während der Isolation und Langzeitkultur (Abbildung 4A,B). Die Fülle von DHPR und Lokalisation, die charakteristisch und einzigartig für vorgerichtliche und ventrikuläre Myozyten war, deutete auf die Anwesenheit von T-Tubulen hin. Darüber hinaus war die Kolokalisierung von DHPR mit RYR2-Immunostainierung ein Indikator für intakte Diadstrukturen. Die Immunostainierung des sarkomischen Proteins Alpha-Actinin in vorgerichtlichen und ventrikulären Herzmyozyten führte zu dem erwarteten sarkomischen Striationsmuster. Das sarkomische Striationsmuster wurde verwendet, um die Reinheit und Lebensfähigkeit isolierter Herzmyozyten in Verbindung mit stabförmiger morphologischer Form und kernischer Färbung mit TOPRO-3 zu bewerten (Abbildung 4C,D; lila und rot). Wie erwartet, waren ventrikuläre Herzmyozyten groß und zeigten eine durchschnittliche Länge von 150 mm, während vorgerichtliche Herzmyozyten durchschnittlich 75 mm betrugen. Darüber hinaus zeigten vorgerichtliche Herzmyozyten (aber nicht ventrikuläre Herzmyozyten) bei der immunfärbungsanalyse eine robuste Expression von atrialem natriuretischem Peptid (ANP) in einem Färbungsmuster, das für die Lokalisierung des endoplasmatischen Retikulums und des sekretorischen Granulats charakteristisch war (Abbildung 4C,D; grün). Ein merkmalstypisches Herzmyozyten ist seine Einstufung als endokrine Zelle zusätzlich zu kontraktilen Zellen. Während vorGericht Myozyten anP unter basalen Bedingungen absondern, Sekretion erhöht als Reaktion auf Sekretagogen (d.h. die alpha-adrenergen Agonisten, Phenylephrin [PE]). Darüber hinaus sekretieren vorgerichtliche Herzmyozyten ANP und verarbeiten gemeinsam einen Teil des Hormons aus seinem Vorläuferzustand (Pro-ANP, 15 kD) zum Produkt Peptid (ANP 3kD)16,17. Diese sekretole Fähigkeit kann durch Immunoblot-Nachweis von ANP in den Medien isolierter vorgerichtter Herzmyozyten als Reaktion auf eine akute PE-Behandlung quantifiziert werden (Abbildung 4E). Diese sekretore und Verarbeitungsfähigkeit der vorhofen Herzmyozyten wurde festgestellt, dass empfindlich auf Kultivierungsbedingungen. Daher ist es zwingend notwendig, dass das vorhofflende Myozytenbeschichtungsmedium mit Dexamethason, Insulin, Transferrin und Selen ergänzt wird. Abbildung 1: Schematische Übersicht über retrograde Herzperfusion, Verdauung und Zellisolation. Gezeigt werden die wichtigsten Schritte bei der Zellisolierung von Atrial- und Ventrikulärkammern gleichzeitig von einem einzigen Mausherz. (A) Ein einzelnes Mausherz wird schnell über die aufsteigende Aorta kanüliert und retrograde Weise durchtränkt. (B) Das Herz wird zur weiteren Verdauung und körperlichen Trennung in vorgerichtliches und ventrikuläres Gewebe getrennt. (C) Nach ausreichender Verdauung werden die Zellen durch Gravitationsfiltration in insgesamt vier zelluläre Fraktionen getrennt, die für nachfolgende Experimente kultiviert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Morphologische Analyse isolierter vorgerichtlicher und ventrikulärer Herzmyozyten und Nichtmyozyten in der Kultur. (A) Isolierte erwachsene Maus-Vorhofmyozyten (AMAMs), (B) erwachsene Maus-Vorhof-Nicht-Myozyten (AMANMs), (C) erwachsene Maus ventrikuläre Myozyten (AMVMs) oder (D) erwachsene Maus ventrikuläre Nicht-Myozyten (AMVNMs) wurden bei 5 x 105 Zellen/Kammer auf Vierkammer-Glas (1,7 cm2) Glas in jeweiligen Plattenplatten plattiert. Phasenbilder wurden an angegebenen Tagen in der Kultur mit einem 10-fachen Objektiv unter einem Epifluoreszenzmikroskop gewonnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Repräsentative qRT-PCR-Analyse isolierter Zellkulturen. RNA wurde aus frisch isolierten Kardialmyozyten und Nicht-Myozyten extrahiert, und mRNA-Spiegel für zellspezifische Genmarker wurden durch qRT-PCR4bestimmt. (A) Tnnt2, Herzmuskeltroponin T (Herzmyozytenmarker); (B) Nppa, vorhofes natriuretisches Peptid (Atrialmyozytenmarker); (C) Myl2, Myosin-Lichtkette 2 (ventrikulärer Myozytenmarker); (D) Tcf21, Transkriptionsfaktor 21 (Fibroblastenmarker); (E) Pdgfra, Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktorrezeptor A (Fibroblastenmarker); (F) Cd68, Differenzierungscluster 68 (monozytenabgeleiteter Zellmarker). Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (*p ≤ 0,05, der sich von allen anderen Werten unterscheidet, wie von ANOVA bestimmt, gefolgt von Newman Keuls Post-hoc-Analyse). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Repräsentative morphologische und funktionelle Analyse isolierter vorgerichtlicher und ventrikulärer Herzmyoykten. (A) AMAMs oder (B) AMVMs wurden mit 5 x 105 Zellen/Kammer auf Vierkammer-Glasgletten in den jeweiligen Beschichtungsmedien für 1 h plattiert, um eine Haftung zu ermöglichen. Es folgten entweder die Vorspeise myozytenbeschichtungsmedien oder der Wechsel zu ventrikulären Myozytenpflegemedien, die mit Blebbistatin für weitere 16 h ergänzt wurden. Die Kulturen wurden anschließend für RYR2 (lila), DHPR (grün) und nuklearen Fleck TOPRO-3 (rot) immunstainiert. (C) AMAMs oder (D) AMVMs wurden isoliert und plattiert, dann immunstainiert für a-Actinin (lila), ANP (grün) und TOPRO-3 (rot). Gezeigt werden zwei repräsentative Bilder für jeden Zelltyp. (E) AMAMs wurden mit 5 x 105 Zellen/gut auf einem 12-Well-Kulturgericht für 16 h in vorgerichtlichen Myozyten-Beschichtungsmedien plattiert. AMAMs wurden anschließend 0,5 h lang mit dem Fahrzeug oder dem ANP-Sekretagog (Phenylephrin, 50 mM) behandelt, bevor Medien gesammelt und immunoblot-Analysen für ANP unterzogen wurden. Vor der Immunoblot-Analyse wurden Medienproben mit 500 x g für 5 min zentrifugiert, um Zellablagerungen zu entfernen und sicherzustellen, dass der beobachtete ANP das Ergebnis einer aktiven Sekretion von AMAMs war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die Qualität der zellenisoliert nach dem hier beschriebenen Verfahren, wie durch die Zellausbeute und die allgemeine Gesundheit der Zellen in kultur bestimmt, hängt von zahlreichen kontrollierbaren Faktoren ab. Beginnend mit der Maus selbst, wurde dokumentiert, dass Stress auf das Tier auferlegt kann negativ beeinflussen Zellertrag und Lebensfähigkeit in der Kultur, vermutlich aufgrund von überschüssigen systemischen Cortisol, Katecholamine, und der hyperkontraktilen Zustand desHerzgewebes 2,5,7. Aus diesen Gründen sollten Maßnahmen ergriffen werden, um eine Alarmierung des Tieres vor dem Opfer zu vermeiden. Zu diesen Maßnahmen gehören die Abdeckung des Käfigs des Tieres und die Begrenzung der Zeit außerhalb des Vivariums vor dem Opfern. Heparin und viele Barbiturate, die häufig für Diethanasie verwendet werden, können Signalwege beeinflussen; Daher sollte die optimale Methode der Euthanasie entsprechend angepasst werden. Das Alter des Tieres hat einen erheblichen Einfluss auf die Qualität und Lebensfähigkeit isolierter Zellen, wahrscheinlich aufgrund der fortschreitenden Anhäufung von interstitiellem Fibrose, die gleichzeitig mit dem Alterungsprozess auftritt, was die Gewebeverdauung beeinträchtigen kann25. In Daten, die hier nicht vorgestellt wurden, während die oben beschriebene Methode bei Mäusen im Alter von bis zu 78 Wochen funktioniert, war die Qualität der Zellen bei diesen älteren Tieren geringer.

Der kritischste Schritt im beschriebenen Isolationsprozess sowie andere Protokolle mit einem Langendorff-Gerät zur retrograden Perfusion ist die Cannulation und Erstdurchblutung des Herzens. Für optimale Ergebnisse sollte die Zeit von der Herzexplantation bis zur Cannulation der aufsteigenden Aorta und der Einleitung der Perfusion nicht mehr als 90 s dauern. Neben der Zeit sind zwei weitere wichtige Faktoren die Tiefe der Kanüle und die Möglichkeit, Luftemboli aus dem Perfusionsapparat einzuführen. Dementsprechend sollte die Kanüle in die aufsteigende Aorta vorgeschoben werden, um nicht in die Aortenwurzel einzutreten und die Aortenklappe zu behindern, was die Durchblutung der Herzkranzgefäße beeinträchtigen würde.

Während des Verdauungsprozesses ist es wichtig, regelmäßig die Steifigkeit des Herzens zu testen, um eine längere Exposition gegenüber der Verdauungsenzymkollagenase zu vermeiden, die die Kalziumtoleranz der Herzmyozyten reduziert. Das oben beschriebene Protokoll für die Wiedereinführung von Kalzium in die isolierten ventrikulären Myozytenkulturen wurde entwickelt, um den Tod von Herzmyozyten durch unangemessenen Kalziumzufluss über speicherbetriebene Kalziumkanäle zu begrenzen. Es sollte beachtet werden, dass die schrittweise Kalziumwiedereinführung nicht für isolierte Vorhoffyzuskulturen durchgeführt werden sollte, da dies den Zelltod während der kurz- und langfristigen Kultur fördern wird12. Zur weiteren Vorsichtgehören gehören die hier verwendeten Perfusions- und Verdauungspuffer den Herzmuskelkontraktionsinhibitor Butandionmonoxim (BDM), um eine Hyperkontraktion isolierter Myozyten zu vermeiden, sowie das Calciumparadoxon, die beide die Myozytenlebensfähigkeit beeinträchtigen26. Jedoch, der Wechsel von BDM zu Blebbistatin sollte beachtet werden, da es das bevorzugte Anti-Contractile-Mittel bei der Aufrechterhaltung von Medien für isolierte Herzmyozyten ist. In nicht gezeigten Daten, Blebbistatin verleiht größere Lebensfähigkeit für langfristige Kultur von isolierten Herzmyozyten.

Unmittelbar nach der Isolierung ist es wichtig, die Auswirkungen der Langzeitkultur von Herzzellen, insbesondere Myozyten, zu berücksichtigen. Das hier beschriebene Herz-Nicht-Myozyten-Isolations- und Kultivierungsprotokoll basiert auf gängigen Methoden, die die unterschiedlichen Dichten und Hafteigenschaften verschiedener Herzzellen nutzen. Der Vorteil von Nicht-Myozyten ist ihr hohes Expansionspotenzial in der Kultur; Daher sind sie im Gegensatz zu Herzmyozyten für die Verewigung zugänglich. Jedoch, Es ist bekannt, dass Kultivierung Bedingungen, einschließlich der mittleren Supplementierung mit FBS, herzmyozyten Funktionalität beeinflussen können27. Die hier beschriebenen Kulturmedien wurden entwickelt, um die Lebensfähigkeit zu optimieren und funktionale Derangements zu begrenzen, insbesondere für die isolierten Vorhofmyozyten. Während in Abwesenheit von Blebbistatin-Supplementierung keine unübersehbare kontraktile Fähigkeit in isolierten Herzmyozyten nach Kultur beobachtet wurde, sollten Studien, die sich auf Elektrophysiologie, Kontraktilität und andere einzellige in vivo-basierte molekulare Signalgebung konzentrieren, bald nach der Isolierung durchgeführt werden, wenn die sarkmere Struktur und molekulare Signatur noch die des intakten Herzens imitiert.

Ein Markenzeichen der vorgerichtlichen Myozyten ist ihre Fähigkeit, als endokrine Zelle mit immenser Sekretorienkapazität, zusätzlich zu ihrer kontraktilen Funktion, Mondlicht zu machen. Unter physiologischen Bedingungen produzieren vorhoffalmyozyten große Mengen an ANP, das im endoplasmatischen Retikulum und in großen dichten Kernsekretoganzgranulaten gespeichert wird, die für eine regulierte Exozytose nach Erhalt eines Stimulus16,17vorbereitet sind. Während viele isolierte Vorhofmyozytenstudien sich auf ihre einzigartigen elektrophysiologischen Eigenschaften konzentrieren, ist dies die erste Studie, die ein Kulturmedium entwirft. Dies ermöglicht eine langfristige Lebensfähigkeit sowie die Förderung der gepflegten Funktionen der endokrinen und kontraktilen Eigenschaften von Vorhofmyozyten. Diese neuartige Methode zur Kultivierung sowie die gleichzeitige Isolierung aller Zelltypen aus Atrial- und Ventrikulärkammern aus einem einzigen Mausherz wird nützlich und wirksam für Studien über die physiologischen und pathophysiologischen Eigenschaften sowohl atrialer als auch ventrikulärer Myozyten sein.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E.A.B. wurde von den National Institutes of Health (1F31HL140850), der ARCS Foundation, Inc., San Diego Chapter, unterstützt und ist eine Rees-Stealy Research Foundation Phillips Gausewitz, M.D. Scholar des SDSU Heart Institute. E.A.B. und A.S.B. wurden von der Inamori Foundation unterstützt. CCG by (NIH) gewährt R01 HL135893, R01 HL141463 und HL149931.

Materials

(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560
1 Liter Water Jacketed Reservoir Radnoti 120142-1
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
5-0 Silk Suture Thread Fine Science Tools 18020-50
Adenosine Sigma-Aldrich A9251
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A6003
Bubble Trap Compliance Chamber Radnoti 130149
Calcium Chloride Anhydrous Fisher Scientific C614-500
Carnitine hydrochloride Sigma-Aldrich C9500
Collagenase type 2 Worthington Biochemical Corporation LS004176
Creatine Sigma-Aldrich C0780
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915
DMEM/F12 (1:1; 1X) Gibco 11330-032
Dumont #7 – Fine Forceps Fine Science Tools 11274-20
Epifluorescent micropscpe Olympus X70 IX70
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) Omega Scientific FB-12 Lot# 206018
Fine Scissors – Sharp Fine Science Tools 14060-09
Graefe Forceps Fine Science Tools 11051-10
Headband Magnifiers Fine Science Tools 28030-04
Hemacytometer (Bright-Line) Hausser Scientific 1475
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Inosine Sigma-Aldrich I4125
Insulin-Transferrin-Selenium-X Gibco 51500-056
Isotemp 105 Water Bath Fisher Scientific NC0858659
Isotemp 3006 Fisher Scientific 13-874-182
Joklik Modified Minimum Essential Media Sigma-Aldrich M-0518
Laminin (Natural, Mouse) Gibco 1795024 Lot# 1735572
L-Glutamine Sigma-Aldrich G8540
Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump Cole-Palmer EW-77122-24
Minimum Essential Medium (MEM 1X) Gibco 12350-039
Molecular Biology Grade Water Corning 46-000-CM
Pen Strep Glutamine (100X) Gibco 10378-016
Spring Scissors – 6mm Cutting Edge Fine Science Tools 15020-15
Taurine Sigma-Aldrich T-8691
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Referencias

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Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart. J. Vis. Exp. (160), e61224, doi:10.3791/61224 (2020).
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