来自成人鼠心脏的心外肌细胞、心室肌细胞和非肌细胞的同步隔离和文化

本文报告的所有对小鼠的研究都经过SDSU机构动物护理和使用委员会的审查和批准，并符合国家研究委员会发布的《实验室动物护理和使用指南》。 1. 准备隔离和文化媒体和电镀 在使用前准备 1 升心脏注入介质，将 Joklik 修改的最低基本介质 （MMEM） 添加到 1 升无菌水。将 pH 调整为 7.36，使用 10 N NaOH，然后通过 0.2 μm 过滤器进行过滤，并在 4 °C 下存储长达 2 周。注：乔克利克MM由112毫米纳克、5.4米KCl、1米M MgCl2、9mNaH2PO4和11.1m D-葡萄糖组成。这补充了10米海佩斯（2.38克/升），30米陶林（3.75克/升），2米D-l-肉碱（0.4克/升），2米肌酸，和10米丁胺单一（1.01克/升）。 在注入之前准备消化缓冲液，如下所示：补充50 mL的心脏注入介质与6.25μL的100 mM CaCl2（ 见步骤1.3）和拼贴酶2型（酶活性+310-320 U/mg dw）。注意：在牺牲前称量动物。补充到消化缓冲的拼贴酶类型2的量是由动物的重量决定的（每1克体重2.25毫克拼贴酶类型2）。 要准备100mM CaCl2，添加1.47克CaCl2 至100mL分子生物学级水。搅拌至溶解，然后通过 0.2 μm 过滤器，在室温下存放长达 2 个月。 准备肌细胞停止缓冲区1通过补充90毫升的心脏灌注缓冲液与10毫升的胎儿牛血清（FBS）和125μL的100 mM CaCl2.通过 0.2 μm 过滤器，在 4 °C 下存储长达 2 周。 准备肌细胞停止缓冲区2通过补充114毫升的心脏灌注缓冲液与6毫升的FBS和150μL的10 mM CaCl2.通过 0.2 μm 过滤器，在 4 °C 下存储长达 2 周。 在灌注前准备心房肌细胞电镀介质，通过补充 95 mL 的 Dulbecco 改良鹰介质 （DMEM） 与 4 mL FBS， 1 mL 的 100x 笔 /链球菌 – 谷氨酰胺， 1 mL 的 100 倍胰岛素转移素 – 氦， 和 1 mL 的 10 μm 德萨梅松.通过 0.2 μm 过滤器，在 37 °C 下存储，直到电镀。 通过补充 95 mL 的最低基本介质 （MEM） 与 4 mL FBS， 1 mL 的 100x 笔 /链球菌 – 谷氨酰胺， 10 mL 的 1 M HEPES 溶液， 1 mL 的 100 倍胰岛素转移素 – 氦， 和 0.1 克丁尼多尼单西梅， 准备心室肌细胞电镀介质。通过 0.2 μm 过滤器，在 4 °C 下存储长达 2 周。 通过补充 99 mL 的 MEM，补充 1 mL 的 100 倍胰岛素转移素-氦、0.1 毫克/mL 牛血清白蛋白 （BSA）、1 M HEPES 溶液的 10 mL 和 1 mL 的 100x 笔/链球菌-谷氨酰胺，制备心室肌细胞维持介质。通过 0.2 μm 过滤器，在 4 °C 下存储长达 2 周。 要准备层压涂层实验板和滑梯，解冻鼠标层压素库存溶液（1.19 毫克/mL）。将 10 μL 的层压素库存溶液添加到 DMEM 的每 1 mL 中，然后混合。涂上实验板和幻灯片均匀，并存放在 37 °C， 5% CO2 孵化器至少 1 小时之前灌注， 以允许平衡。注：涂层实验板和幻灯片可在4°C下存储长达2天。 2. 隔离装置 每次隔离之前，通过将气泡陷阱填充到顶部（关闭底部的塞子并保持顶部的塞子打开），用三次 70% EtOH 的完整洗涤清洁系统中的管子和其他组件。 通过将气泡陷阱填充到顶部（关闭底部的塞子并保持顶部的塞子打开），用无菌 H 2 O 冲洗整个系统3倍。 用心脏灌注缓冲液冲洗整个系统，用介质填充半个气泡陷阱。 将循环水浴设置为 37 °C。 将介质水浴设置为 37 °C。 去除腹股油泵管中的任何气泡。 将永久泵的流速调整为 3 mL/min。 3. 外科手术（非生存） 将手术器械浸泡在 70% EtOH 中至少 5 分钟。 将心脏注水介质、肌细胞停止缓冲液和消化缓冲液放置在37°C水浴中。 在使用前将心室肌细胞电镀介质、心室肌细胞电镀介质和心室肌细胞维持介质放置在 37 °C、5% CO2 孵化器 1 小时之前，并松开盖子以实现平衡。 用0.35 mL的肝素注射10周大的雄性或雌性C57b6/j小鼠，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释至100 IU/mL。让药物生效约10分钟。注：如果两颗心脏要接受这种隔离程序，第二只小鼠可以麻醉并在第一个程序的此时施用肝素。为了尽量减少对动物的压力，可以在密封的感应室中使用2%的异氟/氧混合物进行轻麻醉。 用2%的异氟/氧混合物麻醉动物，然后注射五巴比妥（10毫克/mL库存0.3 mL），然后用70%EtOH擦拭来准备胸部。 准备一个绑 5 – 0 丝绸缝合， 准备把心脏液液到灌装罐。手术显微镜旁边的坎努拉山。 快速打开胸部，首先做一个中线皮肤切口，从中腹到下巴，然后进入腹膜与大剪刀，清除隔膜通过钝解剖。然后，用剪刀切掉肋骨笼，在两侧侧面的胸壁上切开。 剪掉心脏和胸壁（包括胸腺）之间的纤维连接。然后，一起切掉肋骨笼。使用小钳子和剪刀，轻轻抬起心脏的顶点，露出心脏的后部。 通过解剖立即低于上升主动脉上的无名动脉来切除心脏，并立即将心脏置于冰冷的PBS或冷心灌注介质中。随后，迅速解剖出冰冷心脏注水介质中从被切除的心脏中分离出的剩余组织，露出上升的主动脉。注：用胸腺完好无损地切除心脏作为解剖地标是有用的。 使用微解剖钳和剪刀清洁多余组织主动脉周围的区域。使用细尖钳将主动脉放置在管子上，并用 5-0 丝缝固定。注意：最好的位置通常发生在主动脉延伸约2毫米的管子上。 以 3 mL/min 的流速为 4 分钟注入心脏灌注介质。然后将介质从心脏注水介质切换到消化缓冲液，进行 15.0-17.5 分钟的注水（图 1A）。注：冠状动脉流动率可能会增加，表明有效的组织消化（即苍白，肿胀的心脏）。 在注水的最后几分钟收集 8 mL 的消化缓冲流，供第 5.4 步以后使用。 从管子中取出心脏，放在60毫米的塑料培养皿上。取出多余的组织（即主动脉、静脉），将心脏浸入2.5 mL的消化缓冲液中，为机械分离做准备。注：此时，对心室进行解剖，一名实验者应执行心室细胞隔离方案，而第二名实验者应进行心室细胞分离。 4. 纹状细胞隔离与培养 解剖远离心脏的阿提亚，并将其放入一个30毫米的塑料培养盘。将其浸入0.75 mL的消化缓冲液中，用于机械分离。将心室保持在 60 毫米盘中（步骤 3.12），同时执行单独的隔离方法（第 5 节，图 1B）。注：此时，如果需要分离左侧和右侧细胞，腹膜和心室可以进行进一步分离。 开始切碎和取笑阿提亚分开， 最初用细尖手术剪刀， 然后细钳子进一步切碎。避免搅动组织，不要快速拉开肌肉纤维。 使用无菌转移移液器尖端，继续轻轻地混合和分离组织15分钟。每5分钟观察一次在10倍目标光场显微镜下与组织分离的体外肌细胞分离。当组织进一步消化时，继续使用毛孔尺寸较小的无菌转移移液器尖端轻轻地混合和分离组织。 将细胞悬架转移到2mL无菌微离心管中。用 37 °C 肌细胞停止缓冲区 1 的 0.75 mL 冲洗 30 mm 板，并与单元格悬架（端体积 = 1.5 mL）相结合。 让心房肌细胞在室温下通过重力沉积10分钟。轻轻搅拌细胞悬浮物，让肌细胞沉积到圆锥管底部，形成可见的颗粒。 离心细胞悬浮5分钟，在20 x g。小心地去除含有非肌细胞的超纳坦，并使用无菌移液器尖端转移到 15 mL 聚丙烯锥形管中，而不会干扰心房肌细胞的颗粒。 离心非肌细胞分数为5分钟，在20，000 x g。吸附超纳坦，在10 mL的DMM中重新悬浮非肌细胞颗粒，并辅以10%的胎儿小腿血清（FCS）。 使用血细胞计或其他方法计算非肌细胞，然后根据实验需要板，或通过荧光激活细胞分类进一步分离成单个特定细胞群（图1C）。 在1mL的体外肌细胞电镀介质中从步骤4.6中重新悬浮分离的体外肌细胞颗粒，并将10μL的这种悬架涂抹在造细胞仪上。执行每个字段的杆形肌细胞的细胞计数。 从预涂层实验板/滑梯中吸附层压素，并在适当体积的心外肌细胞电镀介质中重新悬生分离的心外肌细胞，并辅以25μM blebbistatin。每个实验需要所需的密度板（图 1C）。注：此处描述的长期栽培的典型电镀密度为四室（1.7 厘米2）玻璃滑梯上的 5 x 105单元/室。 5. 心室细胞隔离和文化 开始切碎和取笑心脏分开心室组织，首先用细尖手术剪刀，然后细钳进一步切碎（图1B）。避免通过快速拉开肌肉纤维来搅动组织。 将电池悬架转移到 15 mL 聚丙烯锥形管中。用 2.5 mL 的 37 °C 肌细胞停止缓冲区 1 冲洗板，并结合细胞悬架（端体积 = 5 mL）。 使用无菌转移移液器尖端，继续轻轻地混合和分离组织4分钟。将此细胞悬架的 10 μL 涂抹在滑梯上，可视化棒状肌细胞的存在，以确保隔离质量。 通过 100μm 无菌尼龙过滤器将细胞悬架传递到 50 mL 聚丙烯锥形管中。使用第 3.12 步收集的 2 mL 消化缓冲液，从无菌尼龙过滤器中清洗任何剩余的细胞。 让心室肌细胞在室温下通过重力沉积6分钟。轻轻搅拌过滤的细胞悬浮物，使肌细胞沉积在圆锥体底部，形成可见的颗粒。 在不干扰心室肌细胞颗粒的情况下，小心地取出超纳坦（非肌细胞），使用无菌移液器尖端转移到 50 mL 聚丙烯锥形管中。离心非肌细胞分数为5分钟，在20，000 x g。吸气超纳坦和重新悬浮非肌细胞颗粒在10 mL的DMEM补充10S。 使用半球形计计算非肌细胞，并在适当的DMEM量中重新悬生，并辅以10S。然后，根据实验需要板，或进一步隔离到个别特定的细胞群通过荧光激活细胞排序（图1C）。 将分离的心室肌细胞在2 mL的肌细胞停止缓冲区2中重新悬浮，并将10μL的细胞悬浮物涂抹在血细胞计上。执行每个字段的杆形肌细胞的细胞计数。 使用渐进式范式重新引入 Ca2+注：钙重新引入步骤是特定于心室肌细胞的，不应该为心室肌细胞执行，因为这将导致细胞死亡。 在心室肌细胞悬浮液中添加 50 μL 的 10 mm CaCl2。 混合好，在室温下孵育4分钟。 在心室肌细胞悬架中再添加 50 μL 的 10 mM CaCl2。 混合好，在室温下孵育4分钟。 在心室肌细胞悬浮液中再添加 100 μL 的 10 mM CaCl2。 混合好，在室温下孵育4分钟。 将 100 mM CaCl2 的 80 μL 添加到心室肌细胞悬架中。混合好，在室温下孵育4分钟。 根据实验需要（图1C），从板或滑梯上取下层压涂层，将分离的心室肌细胞重新悬生在适量的心室肌细胞电镀介质中。注：此处描述的长期栽培的典型电镀密度为四室（1.7 厘米2）玻璃滑梯上的 5 x 105单元/室。避免电镀的密度大于75%的汇合，因为细胞过密度促进细胞团块，从而抑制对板的依恋。此外，在第一次介质变化期间将丢失大量细胞。板状细胞在分离后迅速，因为细胞外Ca2+促进过度竞争和失去可行的肌细胞。 允许心室肌细胞沉淀并粘附至少1小时。随后将介质改为心室肌细胞维持介质，辅以25μM布比斯塔汀。注：在 μM 布利比斯塔汀中电镀后，心室肌细胞可培养至 96 小时。实验应在室外肌细胞维持介质中进行，而不要使用布比斯塔汀。