Ingresso circadiano della Drosophila Melanogaster

1. Produzione alimentare a mosca Ogni 1 L di acqua, preparare il cibo a mosca composto da 4,69 g di melassa essiccata, 19,70 g di lievito attivo secco, 87,22 g di farina di mais e 7,83 g di agar. Unire il contenuto sopra elencato in un crockpot e trasformare il calore a 250 gradi centigradi. Mescolare bene come gli ingredienti sono aggiunti. Tenere il coperchio sul crockpot come il cibo mosca si riscalda, mescolando anche il contenuto ogni 10 minuti fino a raggiungere un ebollizione rotolamento. Lasciare che l’ebollizione continui per 20 minuti prima di spegnere il fuoco. Aggiungere 83,60 mL di acqua e tenere il coperchio del crockpot fuori come il cibo si raffredda. Mescolare e registrare la temperatura del cibo ogni 10 minuti con un termometro di vetro. Evitare di lasciare che uno strato di pellicola si stabilisca in cima al cibo. Una volta che il cibo si è raffreddato a 60 gradi centigradi, aggiungere 10,44 mL di Tegosept e 5,51 mL di acido propionico per litro di acqua aggiunta (vedere il punto 1.1). Mescolare bene e riscaldare fino a 60 gradi centigradi per evitare che il cibo diventi troppo fresco. Pompare il cibo a mosca secondo necessità utilizzando il Droso-filler. Per fiale strette, pompa 10 mL e per 6 oz bottiglie di fondo quadrato pompa 60 mL. 2. Raccogliere mosche di età definita Monitorare le bottiglie di mosche di tipo selvatico conservate a 25 gradi centigradi per 5-7 giorni fino a quando grandi quantità di pupa (circa 200 pupa) sono attaccate al lato della bottiglia. Le bottiglie utilizzate sono bottiglie di brodo Drosophila da 6 oz con fondo quadrato. Cancellare gli adulti esistenti dalla bottiglia. O versare gli adulti in una nuova bottiglia o metterli in 70% etanolo. Utilizzare l’estremità opaca di #0 pennello per spingere gli adulti rimanenti nel cibo mosca. Assicurarsi di pulire il pennello verso il basso con 70% etanolo prima e dopo gli usi. Lasciare riposare le bottiglie sgomberate per 3 giorni in un’incubatrice di 25 gradi centigradi per consentire la chiusura della prossima generazione. Queste mosche avranno tra 0 e 3 giorni. 3. Separazione del volo Dopo 3 giorni, separare i maschi dalle femmine e raccogliere il numero desiderato per ogni sesso per ciascuno dei quattro punti di tempo. Le mosche possono essere differenziate dal sesso esaminando i genitali; i maschi hanno genitali arrotondati scuri, mentre le femmine hanno genitali più chiari e più appuntiti. Le femmine sono anche molto più grandi delle mosche maschili. Utilizzare uncuscinetto di anestesia CO 2 per separare efficacemente le mosche e distinguere tra i sessi. Spostare le mosche con pennelli di vernice per evitare di ucciderli. Raccogliere 100 maschi e 100 femmine per ogni punto di tempo, con 50 maschi per fiala e 100 femmine per fiala. I maschi tendono ad essere più aggressivi e le loro interazioni sociali portano a un sacco di morti quando ci sono 100 individui in una fiala. Le femmine- fino a 100 individui- non sono influenzate mentre sono contenute nella fiala. Eseguire le raccolte nei seguenti punti di tempo: T1, T7, T13 e T19 (Tabella 1). Si noti che le collezioni fatte al buio (T12- T24) sono sensibili alla luce, mentre le collezioni di T0-T11 vengono eseguite durante gli orari delle luci e le luci della stanza possono essere accese. Si prega di notare che due incubatori separati vengono utilizzati con modelli di luce inversa di 12 ore per consentire a tutte le collezioni di verificarsi durante il giorno e non durante la notte. Utilizzare mosche in eccesso per creare nuove bottiglie di mosche per l’intrappolamento futuro. Mettere 25 femmine con 5-7 maschi in ogni nuova bottiglia e mettere nell’incubatrice a 25 gradi centigradi. 4. Vola incubazione Lasciare che le mosche rimangano in incubatrici regolate leggere per 3-5 giorni per consentire l’intrappolamento circadiano. Garantire che le incubatrici siano a tenuta leggera perché anche piccole quantità di inquinamento luminoso disturbano l’intrappolamento. 5. Fissazione dell’immunofluorescenza Dopo l’intrappolamento, preparare nuove fiale di soluzione di fissazione per i campioni che verranno utilizzati per l’immunofluorescenza. Prima di rimuovere i moscerini dall’incubatrice, aggiungere 4,8 mL del 4% di formaldeide diluita in 1x PBS – 0,1% Tween-20 a ogni nuova fiala stretta per ogni 100 mosche che devono essere fissate. Ogni fiala ospita 100 mosche operate circadiane maschili o 100 femmine. Posizionare le fiale strette nel ghiaccio. 6. Raccolta di immunofluorescenza Quando si raccolgono le mosche dall’incubatrice per l’immunofluorescenza, rimuovere il tappo della bottiglia e invertire rapidamente la bottiglia nell’imbuto. Toccare delicatamente le mosche nella soluzione tramite l’imbuto per guidare le mosche nella fiala; combinare due tubi dei 50 maschi per un totale di 100 maschi in una fiala e utilizzare un singolo tubo di 100 femmine per l’altra fiala. Eseguire le collezioni T13 e T19 al buio; utilizzare una luce rossa per vedere come drosophila sono molto meno sensibili a queste lunghezze d’onda della luce e sono quindi meno inclini all’inquinamento luminoso13. La proteina Cryptochrome, in particolare, è particolarmente sensibile alla luce blu, che deve essere evitata14. Per ridurre l’esposizione alla luce, assicurarsi che la stanza di raccolta sia leggera e con qualsiasi fonte di luce bloccata o coperta. Avvolgere queste fiale in un foglio in modo che le mosche T13 e T19 non siano esposte alla luce quando vengono poste sul miscelatore di nutating nel passaggio successivo. Le mosche T1 e T7 non sono sensibili alla luce e possono essere posizionate sul mixer senza rivestimento di lamina. 7. Miscelatore e stoccaggio Dopo che le mosche sono state raccolte, nastro la parte superiore delle fiale contenenti fissativo per evitare fuoriuscite e metterli sul mixer nutating a 165 RPM a 4 gradi centigradi per 4 h. Le mosche non sono più sensibili alla luce dopo questa fase di fissazione, quindi la lamina può essere rimossa per verificare che la soluzione si muove e le mosche vengono sommerse nel fissativo. Dopo aver rimosso la mosca contenente fiale dal miscelatore nutating rimuovere la formaldeide e lavare tre volte con 3.000 L di 1x PBS, invertendo la fiala con ogni lavaggio. Conservare le fiale con campioni di immunofluorescenza a 4 gradi centigradi per attendere la futura immunofluorescenza15. 8. Raccolta per l’estrazione delle proteine Preparare quattro tubi da 50 mL e un dewar contenente azoto liquido per la conservazione dei campioni per l’estrazione delle proteine Per la raccolta di mosche per l’estrazione di proteine o acidi nucleici, trasferire le mosche dalle bottiglie al tubo nello stesso modo di cui al punto 6.1 e bloccare rapidamente il tubo per impedire il rilascio di mosche e posizionare il tubo in azoto liquido per bloccare. 9. Stoccaggio per l’estrazione delle proteine Conservare i campioni congelati a scatto per l’estrazione delle proteine a -80 gradi centigradi. Questi possono essere elaborati secondo il protocollo di estrazione delle proteine appropriato per l’analisi a valle, compreso l’immunoblotting16.