Studiare gli effetti del fumo di sigaretta sull'infezione da pseudomona nelle cellule epiteliali polmonari

Il fumo di sigaretta influisce sulla salute pubblica di milioni di persone in tutto il mondo. Molte malattie deleterie, tra cui il cancro ai polmoni e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), sono segnalate per essere correlate al fumo di^{sigaretta 1,2}. Il fumo di sigaretta aumenta la suscettibilità alle infezioni microbiche acute nel sistema^{respiratorio 3,4,5}. Inoltre, prove crescenti dimostrano che il fumo di sigaretta migliora la patogenesi di molti disturbi^{cronici 6,7,8}. Ad esempio, il fumo di sigaretta può aumentare le infezioni virali o batteriche che causano l’esacerbazione della^{BPCO 9}. Tra i patogeni batterici che contribuiscono etiologicamente all’esacerbazione acuta della BPCO, un patogeno opportunistico del bacillo gram-negativo, Pseudomonas aeruginosa, provoca infezioni che correlano con cattive prognosi e superiori morti^10,11. L’esacerbazione della BPCO peggiora la malattia accelerando la progressione patologica. Non esistono terapie efficaci contro l’esacerbazione della BPCO ad eccezione della gestione antinfmatica¹². L’esacerbazione della BPCO favorisce la mortalità dei pazienti, diminuisce la qualità della vita e aumenta l’onere economico per la^{società 13}.

Le vie respiratorie sono un sistema aperto, continuamente sottoposto a vari patogeni microbici presenti esternamente. I patogeni batterici opportunistici sono di solito rilevati nelle vie aeree superiori, ma a volte sono osservati nelle vie^{aeree inferiori 14,15}. Nei modelli animali P. aeruginosa può essere rilevato nelle sacche di alveolar non appena 1 h dopo l’infezione¹⁶. Come principale meccanismo di difesa, le cellule immunitarie come macrofagi o neutrofili eliminano i batteri nelle vie aeree. Le cellule epiteliali polmonari, come prima barriera fisiologica, svolgono un ruolo unico nella difesa ospite contro le infezioni microbiche. Le cellule epiteliali polmonari possono regolare l’invasione microbica, la colonizzazione o la replicazione indipendentemente dalle cellule^{immunitarie 17}. Alcune molecole presenti nelle cellule epiteliali, tra cui PPARg, esercitano funzioni antibatteriche, regolando così la colonizzazione batterica e la replicazione nelle cellule epiteliali polmonari¹⁸. Il fumo di sigaretta può alterare le molecole e compromettere la normale funzione di difesa nelle cellule epiteliali^{polmonari 19,20}. Recenti studi hanno segnalato l’esposizione diretta del fumo di sigaretta alle cellule epiteliali polmonari utilizzando l’apparato di fumo robot^21,22. L’esposizione al fumo può essere eseguita in altri modi, tuttavia, compresa l’applicazione di CSE. La preparazione della CSE è un approccio riproducibile con potenziali applicazioni in altri tipi di cellule, comprese le cellule endoteliali vascolari che sono indirettamente esposte al fumo di sigaretta.

Questo rapporto descrive un protocollo per generare l’estratto di fumo di sigaretta per alterare il carico batterico nelle cellule epiteliali polmonari. CSE aumenta il carico batterico di P. aeruginosa, e può contribuire alla ricorrenza di infezioni batteriche di solito visto in esacerbazione BPCO. Un metodo convenzionale viene utilizzato per la preparazione di CSE. Le cellule epiteliali polmonari, nella loro fase di crescita esponenziale, sono trattate con 4% CSE per 3 h. In alternativa, le cellule epiteliali polmonari monostrato possono essere direttamente esposte al fumo di sigaretta in un’interfaccia aria-liquido. Le cellule trattate con CSE vengono quindi sfidate con Pseudomonas a una molteplicità di infezione (MOI) di 10. I batteri vengono propagati ad una particolare velocità di agitazione per garantire che la morfologia dei loro flagelli rimanga intatta per mantenere la loro piena capacità invasiva. La gentamicina viene impiegata per uccidere i batteri lasciati nel mezzo di coltura, riducendo così la potenziale contaminazione durante la successiva determinazione del carico batterico. Il protocollo utilizza anche Pseudomonasetichettata GFP , che è stato utilizzato come potente strumento nello studio dell’infezione da Pseudomonas in diversi modelli. Un ceppo rappresentativo è P. fluorescens Migula²³. Il grado di infezione o carico batterico dopo il trattamento della CSE è determinato in tre modi: il metodo della piastra di caduta con conteggio delle colonie, la PCR quantitativa che utilizza primer specifici di 16S o la citometria di flusso nelle cellule infettate da Pseudomonas fluorescenti. Questo protocollo è un approccio semplice e riproducibile per studiare l’effetto del fumo di sigaretta sulle infezioni batteriche nelle cellule epiteliali polmonari.