二重マーカーを用いたモザイク解析を用いた大脳皮質の開発における系統トレースとクローン解析(MADM)

マウスプロトコルは、ISTオーストリアの機関前臨床コア施設(PCF)および内部倫理委員会によって審査されました。すべての繁殖と実験は、オーストリアとEUの動物法に従ってオーストリア連邦科学研究省によって承認されたライセンスの下で行われました。 1. MADMクローン解析用の実験用マウスの育種 時間指定実験 MADM 交配をセットアップする (>P56;CD-1)午後遅く(午後5時)に、経膣のプラグが進行する朝(午前8時)をチェックします。プラグが存在する朝は 0.5 日としてカウントされます。実験的なマウスの交配設定の概要については、図 2を参照してください。CreERT2活性および分析のTM誘導のタイムポイントが実験問題に対応するのに適切であることを確認します。注: 詳細については、図 3と下記の代表的な結果を参照してください。 出生後サンプリングでは、並行して里親を生成するために繁殖を設定します。注意: これらは、実験用の繁殖を設定する前に、1-2日まで開始する必要があります。 2. MADMマウスにおけるTM誘導 コーンオイルに15mLまたは50mL円錐遠心管に溶解し、室温(RT)で〜4時間のロッキングプラットフォームに置き、TMが完全に溶解していることを確認して、20mg/mL TMの作業溶液を調製します。アルミホイルで覆われた4°Cで作業溶液を保管し、2週間以内に使用してください。 MADMの再結合イベントを誘導するために、1 mLの結核菌注射器と25G針を用いて、TMの腹腔内(IP)を時当たりの妊娠ダムに注射する。皮質神経新生の段階に応じて、E10-E15間のTMを1-2 mg/妊娠ダムの用量で注入してください。早期の時点(E10)の場合、妊娠11の間の合併症を予防するために最大1mg/妊娠ダム(25mg/kg)を使用する。E11-E15間のタイムポイントは2mg /妊娠ダム(50mg /kg)7を使用してください。注:あるいは、TMは後期妊娠のための経口ギャージで投与することができる。 MADMクローン解析で出生後のタイムポイントを解析するには、帝王切開を通じてE18-E19で生きた胚を回収し、養母と一緒に子犬を育てます。注:妊娠中の女性の健康状態によっては、帝王切開を行う必要はないかもしれませんが、元のTM治療を受けた母親が授乳に問題を抱えている可能性があるため、里親と一緒に子犬を育てる必要があります。 帝王切開で生きた胚を回収するか、または分析のために胚のタイムポイントを取り出すために、子宮頸部脱臼によって妊娠したダムを犠牲にする。 動物をサピーヌの位置に置き、70%エタノールで毛皮を消毒します。外科的鉗子とはさみを使用して、子宮の上腹部の皮膚に小さな切開を行います。腹膜を明らかにするために筋肉と腹筋壁を通して第二の切開を行います. 周囲の組織からはさみで切り離して子宮を取り除きます。インタクトな子宮を温水で満たされた手袋に移し、それぞれが羊膜から個別に取り除かれるまで胚生存率を高める。 細かい先端のはさみと指を使用して、子宮壁を慎重に開いて胚を放出します。大きな失血を防ぐために、臍帯を体の近くに切りすぎないでください。胚を分析に使用する場合は、ステップ3.9に進みます。子犬を育成する場合は、ステップ2.8に進みます。 養育が必要な場合は、子犬を養母に移す前に子犬を清掃してください。子犬を掃除しながら、時々胸を軽く押して呼吸を開始します。生存率を向上させるために、暖かい水で満たされた第二の手袋に戻します。注:残りの羊膜や胎盤をペーパータオルで静かに取り除く必要があります。 子犬を里親に移す前に、ケージから里親を取り除き、元の子犬を取り除き、実験的な子犬に置き換えてください。里親をケージに戻します。注: 受け入れ率の促進を改善するための追加の提案については、ディスカッションを参照してください。 ジェノタイピングが必要な場合は、P6-P8間のつま先または尾の生検を収集します。注: この手順は、動物実験ライセンスがこの実習を承認した場合にのみ実行してください。 3. MADM クローンの脳内組織準備 注:出生後組織(≥P4)を含む実験の場合は、ステップ3.1に進みます。胚のタイムポイントと早期出生後(P0-P3)の場合は、ステップ3.9に進みます。 ケタミン/キシラジン/アセプロマジン溶液(それぞれ65mg、13mg、および2mg/kg体重)のIP注入で実験MADM動物を麻酔し、後足をつまんでマウスが反応しないことを確認します。注: 男性と女性の両方の MADM マウス (CD-1 バックグラウンド) は、分析に使用されます。ジェノタイピングが必要な場合は、この時点で耳の生検を収集します。 麻酔動物を灌流手術トレイの上のスペイン位置に置き、70%エタノールで毛皮を消毒します。手術を開始するには、皮膚の外層を通してハサミと外科用鉗子で切開し、筋肉層を通して2回目の切開を慎重に行います。胸骨の先端を持ち上げ、肝臓を切断しないように特別な注意を払って、側面の結合組織を切断します。胸腔が見えます。 横隔膜を切り取り、心臓を明らかにするために持ち上げます。慎重に心臓を露出させるために外科用トレイにリブケージとピンをトリミングします。子犬の場合は、リブケージを完全に取り外します。 リン酸緩衝生理食塩液(PBS)の針を左下心室(paler組織)に挿入します。小さな虹彩はさみを使用すると、血液が排出される右心房(暗赤色組織)の後端に切開を行う。 PBSですぐに作りたての氷冷4%パラホルムアルデヒド(PFA)での灌流を行う。子犬(P4-P10)の場合は、注射器を使用して灌流を行います。1つの注射器を10mLのPBSで満たし、もう1つは4%PFAの10 mLで満たします。シリンジ内のすべての気泡が取り除かれていることを確認します。古い動物の場合は、蠕動ポンプを使用してください。 PBS(子犬では2-4 mL/分で10 mL、蠕動ポンプを使用する大人の場合は4-6 mL/minで20 mL)でパーファを開始します。針が正しく配置されていれば、肝臓は透明になり、淡い黄色になります。 完成したら、子犬から針を取り出し、PFAを含む針を同じ穴に挿入します。成人の場合は、PBS溶液を氷冷PFAと交換する前に蠕動ポンプを停止し、取り込みチューブの泡を避けるようにしてください。PFA(子犬の場合は2-4 mL/minで10mL、蠕動ポンプを使用する大人の場合は4-6 mL/minで30 mL)を再開します。 灌流が完了したら、マウスの首を切り落とし、慎重に解剖して脳を取り除く。4%PFAに脳を移す。少なくとも5倍の脳容積(すなわち、15 mL円錐形遠心分離管のPFAの5-10 mL)を使用し、組織の完全な固定を確実にするために、4°Cで一晩インキュベートする。ステップ 3.10 に進みます。 胚組織および出生後初期組織(すなわち、P0−P3)については、帝王切開を行った後、胚をはさみで切断する。ジェノタイピングが必要な場合は、この時点で胚の尾部を収集します。すぐに脳を解剖し、4%PFA/ウェルの2-3 mLを含む12ウェルプレートに移す。4°Cで一晩インキュベートして後置きする。 翌朝、PFAをPBSの10 mL(成体)または2-3 mL(胚)と交換し、RTで15分間3倍の洗浄を繰り返します。 脳を埋め込み型に最適な切断温度(OCT)化合物に埋め込み、コロナまたは矢状の切断のために脳を向くように注意してください。OCT が完全に不透明になるまで、埋め込み金型をドライアイスに配置してフリーズします(10~15 分)。さらに使用するまで-80°Cで組織を保管してください。 4. 免疫組織化学のためのMADM組織の調製 凍結し始めると、ディスクにOCTのリングを適用し、ブロックをOCTに直接配置することによって、クライオスタットの標本ディスクにティッシュブロックを取り付けます。ブロックが目的の切断面に正しく向けられていることを確認します。注: ここでは、皮質MADMクローンを調査するためのコロナ断面について詳しく説明します。 クライオスタットのブロック温度を-20°Cに、ブレード温度を-21°Cに設定します。 標本ディスクを標本ホルダーに取り付けることでチャンバー温度に調整し、切断を開始する前に、組織ブロックを約5分間凍結スタットに残します。 目的の組織領域に到達するまで、厚いセクション(45-60 μm)でブロックをトリムします。 皮質の縁がはっきりと見えたら、切断を止めてブレードをロックします。ブロックをトリミングする前に、ブレードがシールドされていることを確認してください。 骨を持つ組織を囲む余分なOCTをトリミングし、脳の全ての側面に1-2mmのOCTを残します。 次に、皮質の横端の1つが下方に向き、もう1つが上向きになるようにブロックを向けます(すなわち、皮質の最も多い鼻の縁が右に向いています)。 成体クローンの場合は45μm、胚クローンでは30μmの厚さで切り離し始めます。各セクションを個別に実行し、小さなブラシを使用して、ブロックをトリミングしながら残された破片のナイフの下の領域をきれいに保ちます。注: この処理を行わない場合、セクションが落ちると、スライスの正しい順序を判断することが困難になる場合があります。 セクションがカールし始めた場合は、ブロックの端をトリミングしたり、ガラスのアンチロールプレートを慎重に調整します。 胚性クローン分析の場合は、セクションをフロストスライドに直接取り付けます。37°Cの加熱プレートで乾燥してから、ステップ5.6に直接進みます。注: 1 つのスライドに複数のセクションを追加できますが、順番に並べ替えが維持されるようにします。 成虫クローンを収集するには、1 mLのPBS/well(通常、脳あたり5-6プレート)を含む24のウェルプレートを準備します。最初の井戸から始めて、コールド鉗子で切り離す順序でPBSの個々のシリアルセクションを集める。注:フローティングセクション法は、セクションが見逃されていないことを確認し、マウントされたセクションにしわが含まれていないことを保証するために、成体組織に採用されています。 新皮質の終わりに達したら、切除を停止します。 成体クローンの場合は、フローティングセクションの取り付けに進みます。注:セクションは、最大24時間4°CでPBSに保管することができます。 5. イメージング用の成体組織の取り付け 注:次のツールが必要です:小さな塗料ブラシ、ペトリ皿、PBS 0.5%トゥイーン(PBS-T)、接着スライド(材料表)、取り付け媒体(材料表)、カバーリップ、鉗子。 ペトリ皿にPBS-Tを入れます。注意:洗剤は、取り付けプロセスの助けに使用されます。洗剤に敏感な追加の抗原(すなわち、糖タンパク質)の染色が必要な場合は、Tweenの添加をスキップするのが最善です。 貼着スライドをPBS-Tに入れ、ラベルに覆われるようにします。 最初のセクションを PBS-T に移します。 小さなペイントブラシを使用して、スライド上のセクションを操縦し、切断の順序を維持するためにそれを配置します。これ以降のすべてのセクションで同じ方法で進めます。 すべてのセクションが配置されたら、スライド(〜12~16セクション/スライド)を暗いスライドチャンバーに配置します。蓋を少し持ち上げて、セクションを完全に乾燥させます(〜10〜20分)、後続のステップで付着した状態を保ちます。 追加の抗原に対して免疫染色を行う場合は、セクション6または7に直接進む。注意:胚のタイムポイントについては、少なくともGFPおよびtdT(セクション6)に対して免疫染色手順を実行する必要があります。成体クローンの場合、これは、追加の抗原を並行して染色する場合にのみ必要です(セクション6および7)。 水分補給し、残留PBS-Tを除去するために5分間1xPBSでセクション1xを洗浄します。スライドに、1x PBS(1 μg/mL)で希釈した4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)の~1 mLを塗布し、すべてのセクションを覆い、15分間インキュベートします。 DAPIを慎重に取り出し、1x PBSで1xを5分間洗い、110μLの取り付け媒体に埋め込む前に、余分なPBSを取り除き、約1〜2分間乾燥します。24 x 60 mmのカバースリップでシールし、イメージングの前に少なくとも3時間乾燥させます。 6. GFPおよびtdTのみの免疫染色 注: このセクションは、胚性クローンに必要です。 加湿スライドインキュベーションチャンバーに水平にスライドを配置します。必要なバッファーの量を最小限に抑えるために、ワックス マーカーでスライド境界をマークします。 1x PBSで水分補給セクション。染色品質を向上させるために、切り離された新しい組織で作業します。 スライドごとに250-400 μLのブロッキングバッファ(0.5%トリトンX-100、1x PBSで2-3%ノーマルロバ血清)を追加し、すべてのセクションがカバーされていることを確認します。1時間インキュベートする。注:一部の抗原は他のものよりも洗剤に敏感であるため、洗浄剤(Triton X-100またはTween-20)の濃度は、使用される追加の一次抗体によって異なります。 ブロッキングバッファを取り外し、ブロッキングバッファ内の一次抗体をスライドに追加します(300-400 μL/スライド)。注:抗GFP/抗tdT(MADM)の標準的な一次抗体反応の例は、チキン抗GFP(1:500)とウサギの抗RFP(1:500)を使用することができます。 一次抗体を4°Cで一晩インキュベートする。注:スライドは、すべてのセクションをカバーするバッファで完全に水平にインキュベートする必要があります。それ以外の場合は、不均等または汚れが悪くなる可能性があります。 翌朝、一次抗体を持つブロッキングバッファーがスライド上のすべてのセクションをカバーしていることを確認します。それでない場合は、RTで3-4時間のインキュベーションステップを繰り返します。 一次抗体を除去し、RTで10分間1x PBSで4倍洗浄します。 ブロッキングバッファーで希釈した二次抗体をスライド(300-400 μL/スライド)に加える):アレクサFluor 488抗鶏IgG(1:500)およびCy3抗ウサギIgG(1:500) 2時間RTでインキュベートし、蛍光色素の漂白を防ぐために、スライドを光から覆いておいてください。 二次抗体を取り除き、10分間PBSで2倍洗います。 DAPIをPBS(1:5,000)で15分間希釈してインキュベートします。 1x PBSで10分間洗浄します。 110 μLの取り付け媒体に埋め込む前に、余分なPBSを取り除き、約1〜2分間乾燥します。 24 x 60 mmのカバースリップでシールし、イメージングの前に少なくとも3時間乾燥させます。最適なシグナルを確実にするために免疫検査を行った後、1~2週間以内に画像スライドします。 7. GFP、tdT、および追加抗原の免疫染色 ステップ 6.1-6.3 を実行します。 ブロッキングバッファを取り外し、ブロッキングバッファ内の一次抗体をスライドに追加します(300-400 μL/スライド)。注:3つ以上の抗原(すなわち、GFP、tdT、および目的タンパク質)の染色と目的タンパク質の抗体をウサギで上げた場合、抗tdT(ヤギ)一次抗体を1:500の希釈で使用することが推奨されます。代替tdT染色を伴う3つの抗原に対する一次抗体反応の一例は、抗GFP(1:500)、ヤギ抗tdT(1:500)、および目的のタンパク質(ウサギ)に対する抗体を使用することができる。 ステップ 6.5-6.7 を実行します。 ブロッキングバッファーで希釈した二次抗体ミックスをスライド(300-400 μL/スライド)に追加する:アレクサFluor 488抗鶏IgG(1:500)、Cy3抗ヤギIgG(1:500)、アレクサフルオール647抗ウサギIgG(1:500)。 ステップ 6.9-6.14 を実行します。 8. MADMクローンの共焦点画像取得と定量化 クローンと皮質内のそれらの位置を含む脳のセクションを識別し、文書化します。注: クローンが使用するセクション数は、クローンが誘導された時期、CreERT2ドライバ、および分析の時間によって異なります。このステップは、共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡のいずれかで行うことができる。 反転共焦点顕微鏡を使用して、正しいレーザーラインとフィルタを選択して構成します。MADM脳の場合は、DAPI、GFP、およびtdT(励起:358 nm、488 nm、554 nm、それぞれピークエミッション:461 nm、507nm、581 nm)を選択します。最適なイメージング品質を実現するため、ピンホールが 1 つの風通しの良いユニットに設定されていることを確認します。 共焦点固有の設定では、20x の目的と 1 倍のズームを持つイメージ クローン。定量に使用する画像の場合、平均化なしで、1.52-2.06 μs(画像取得ソフトウェアでは値 7-8)のスキャン速度ピクセルの位取り値を使用します。必要に応じて、各チャンネルのレーザー強度とゲイン設定を調整します。注: 必要な画質に応じて、スキャン速度と平均化の設定が異なる場合があります。 クローンが明確に識別されたら、クローン内のすべての関連セクションをカバーするようにイメージングタイルを配置します。クローン内のすべてのMADMラベル付きセルが1.5 μm/zスタックスライスの間隔でキャプチャされるようにZスタックを調整します。タイル領域を調整して、クローンをイメージングする際に皮質の全幅がキャプチャされるようにします(すなわち、パイル表面から脳梁まで)。 連続して複数のセクションにまたがる個々のクローンを画像化し、クローン内のセルを持たないセクションを、3D再構成およびセル空間情報の正しい解釈のために画像化します。 MADMクローンの細胞を含む各セクションを、野間の尾部から尾端まで順次分析する。個々のニューロンとグリアを、その形態および/またはマーカー染色に基づいて区別する。核染色(DAPI)によって定義されたそれぞれの層境界に基づいて、位置情報を並列に記録する。注: 胚分析の代表的な結果については図 4を、成人分析の代表的な結果については図 5を参照してください。 9. クローンのシリアル3D再構成 注:シリアル脳セクションで画像化された個々のクローンの3D再構築は、視覚的な表示だけでなく、3Dクローンアーキテクチャの分析に役立ち、次の手順に従って実行できます。 画像取得ソフトウェアを使用して、取得パラメータに基づいて、共焦点タイル画像をステッチおよびヒューズします。.czi ファイルを開き、ZEN ソフトウェア (Zeiss) の[処理] タブでスティッチ法を実行します。 ステッチされたイメージ スタックを個々の Z 平面として TIFF 形式で書き出します。ステッチされた .czi ファイルを開き、[処理] タブでイメージエクスポート方法を実行します。マルチチャンネル画像の場合は、後続の画像処理のために赤/緑/青画像として書き出します。 クローンのシリアル脳セクションごとに手順 9.1 と 9.2 を繰り返します。注: 正確な 3D 再構成のために、ラベル付き細胞を含まないクローン内のすべての脳セクションも処理する必要があります。 ImageJ/Fiji67,68,68などのオープンソースの画像処理ソフトウェアを使用して、最も多くの rostral から最も大きな大体 z プレーンまでの順に個々の画像を単一のスタックに連結します。注: 各脳セクションの端にある空白の画像は、この時点で削除する必要があります。 必要に応じて、手順 9.5.1-9.5.5 に従って、”MultiStackReg”という名前の ImageJ プラグインを使用して、手順 9.4 から取得したイメージ スタックを修正します。イメージの配置が不要な場合は、手順 9.6 に進みます。注:このプラグインは、最も高いコントラスト(通常はDAPI)でチャンネルの画像のアライメントを実行し、その後、マルチチャンネルスタックの信頼性の高い画像のアライメントを可能にする、他のチャンネルに記録された変換を適用します。”TurboReg”という補助プラグインがプレインストールされている必要があります。 ImageJ で、 “MultiStackReg” および “TurboReg” プラグインをインストールします。 手順 9.4 から取得したクローン イメージのイメージ スタックを開いて整列させます。[イメージ] タブの [色] オプション内で、チャネルを DAPI (青)、GFP (緑)、および tdT (赤) に分割します。 “MultiStackReg”プラグインを実行して、DAPI チャネルを “リジッド ボディ” 変換で整列させ、変換ファイルを保存します。 保存した変換ファイルを”MultiStackReg”を使用して他の 2 つのチャネルに適用します。 3 つの整列されたチャネルをすべて結合し、整列したスタックを保存します。 ImageJでクローンを向けるには、ステップ9.4(または配置後のステップ9.5.5)から得られたクローン画像のスタックを、上部に円膜面を、底部にコーパス梁を持つ垂直方向に回転させます。必要に応じて、xy 平面でトリミングします。 定性的な表示と定量分析の両方で、最大 z 投影イメージを生成するか(ステップ 9.8)、またはクローンの 3D レンダリング(ステップ 9.9)を実行します。 ImageJ で、ステップ 9.6 からイメージ スタックを開き、投影タイプの最大強度の Z 投影オプションを選択します。これにより、同じ平面上に投影されたクローン全体のイメージが生成されます。 ImageJ で、ステップ 9.6 からイメージ スタックを開き、3D Project Z 関数を選択して、回転可能なクローンの 3D ビジュアライゼーションを生成します。注: この手順では、イメージ取得時に個々の Z スタックの厚みと同じ正しいスライス間隔を入力することが重要です。補間ツールは、スライス間のギャップを除去するために使用する必要があります。