Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation

Mahlet  Z. Tamirat; Kari  J. Kurppa; Klaus Elenius; Mark  S. Johnson

doi:10.3791/61125

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioquímica

פענוח ההשפעות המבניות של הפעלת מוטציות סומטיות EGFR עם סימולציה דינמיקה מולקולרית

Published: May 20, 2020

doi:

10.3791/61125

Mahlet Z. Tamirat¹, Kari J. Kurppa², Klaus Elenius^2,3,4, Mark S. Johnson¹

¹Structural Bioinformatics Laboratory, Biochemistry, Faculty of Science and Engineering,Åbo Akademi University, ²Medicity Research Laboratories and Institute of Biomedicine,University of Turku, ³Turku Bioscience Centre,University of Turku and Åbo Akademi University, ⁴Department of Oncology and Radiotherapy,University of Turku and Turku University Hospital

Summary

מטרת הפרוטוקול היא להשתמש בסימולציות דינמיקה מולקולרית כדי לבחון את השינויים המבניים הדינמיים המתרחשים עקב הפעלת מוטציות של חלבון קינאז EGFR.

Abstract

מוטציות סומטיות רבות המתרחשות קולטן גורם גדילה אפידרמיס (EGFR) משפחה (ErbB) של קינאזים טירוסין קולטן (RTK) דווחו מחולים בסרטן, למרות יחסית מעט נבדקו והוכחו לגרום לשינויים פונקציונליים ErbBs. קולטני ErbB הם dimerized ומופעל על איגוד ליגנד, ושינויים קונפורמציה דינמיים של הקולטנים הם טבועים אינדוקציה של איתות במורד הזרם. עבור שתי מוטציות המוצגות באופן ניסיוני כדי לשנות את פונקציית EGFR, A702V ומוטציית המחיקה⁷⁴⁶ELREA^750, אנו ממחישים בפרוטוקול הבא כיצד סימולציות דינמיקה מולקולרית (MD) יכולות לחקור את היציבות הקונפורמציה (1) של מבנה הקינאז מוטציה טירוסין בהשוואה EGFR מסוג פראי; (2) השלכות מבניות ומעברים קונפורמיים ומערכת היחסים שלהם לשינויים פונקציונליים שנצפו; (3) השפעות של מוטציות על הכוח של ATP מחייב, כמו גם על קשירה בין תחומי קינאז ב dimer אסימטרי מופעל; ו-(4) השפעות המוטציות על אינטראקציות מפתח בתוך אתר איגוד EGFR המשויך לאנזים המופעל. הפרוטוקול מספק הליך מפורט שלב אחר שלב, כמו גם הדרכה שיכולה להיות שימושית יותר בדרך כלל לחקירה של מבני חלבון באמצעות הדמיות MD כאמצעי לבדיקה של דינמיקה מבנית ואת הקשר לתפקוד הביולוגי.

Introduction

קולטן גורם גדילה אפידרמיס אנושי (EGFR) משפחה (ErbB) של קינאזים טירוסין קולטן (RTKs) כולל ארבעה חברים – EGFR / ErbB1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 ו ErbB4/HER4. קולטני ErbB לווסת תהליכים תאיים בסיסיים כגון צמיחת תאים והתפשטות,^{בידול, הגירה והישרדות 1,}^,2 ,^ולכןהם פרוטו-oncogenes חזק. פעילות חריגה של קולטני ErbB, במיוחד EGFR ו ErbB2, נקשר לעתים קרובות עם סרטן אנושי ביצוע קולטני ErbB מטרות מפתח עבור סרטן therapeutics^2,^,³.

מספר שינויים סומטיים של גנים ERBB דווחו מממאירות^{אנושית 3,}^,^4,^,⁵. הדוגמאות המאופיינות הטובות ביותר כוללות את המוטציות החוזרות ונשנות, נקודת ההפעלה מחיקות קצרות במסגרת בתחום קינאז EGFR בסרטן ריאות תאים לא קטנים (NSCLC). מוטציות EGFR אלה מייצגות נהגים מרכזיים של צמיחת סרטן, ולנבא רגישות EGFR מיקוד^{תרופות לסרטן 6}^,⁷^,⁸. עם זאת, ברוב סוגי הסרטן, מוטציות סומטיות ב EGFR להתרחש מחוץ אלה חוזרים ונשנים “נקודות חמות” ומופצות על פני כל 1210-שאריות טווח של הקולטן. אכן, רוב השאריות לאורך הרצף הראשי EGFR נמצאו מוטציה בסרטן אנושי⁹. אף על פי כן, מלבד נקודות חמות מעטות, המשמעות הפונקציונלית של הרוב המכריע של מוטציות EGFR הקשורות לסרטן נשאר לא ידוע.

המבנה המונומרי של ErbBs מורכב מתחום חוץ-תאי גדול של מסוף אמינו, ואחריו סליל טרנסמברנה יחיד המוביל לתחום טירוסין קינאז תאי ואזור זנב C-terminal המכיל אתרי עגינה לחלבונים איתות תאיים. כריכת ליגנד מפעילה שינוי קונפורמציה דרמטי בתחום החוץ-תאי, המאפשר היווצרות של דימרים קולטנים על ידי חשיפת זרועות dimerization כי באופן סימטרי לחצות אחד את השני ואינטראקציה עם המשטחים ארומטי / הידרופובי שלהם. על היווצרות דימר קולטן התחומים קינאז טירוסין לבוא במגע אסימטרי(איור 1),וכתוצאה מכך ההפעלה של kinases כי phosphorylate זנבות C-מסוף של מונומרים קולטן, ולאחר מכן בהפעלה של במורד הזרם איתות¹⁰^,¹¹.

איור 1: מבנה דימר EGFR. EGFR מתעמעם כאשר התחומים חוץ תאיים לאגד גורם גדילה (EGF, גורם גדילה אפידרמיס). תחום kinase מקלט מופעל לאחר מכן באמצעות אינטראקציה אסימטרית עם תחום kinase מפעיל, וזנבות C-מסוף הם autophosphorylated בשאריות טירוסין (שונה מ תמיראת ואח^’12). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

בגלל סידורים מבניים דינמיים המתרחשים במהלך המעברים dimer מונומר, יחד עם הפעלת קינאז המשויך להיווצרות של דימר אסימטרי, מוטציות לאורך כל מבנה הקולטן יכול להיות השפעה על תפקוד הקולטן. כאן אנו מתארים מספר דוגמאות מהמחקרים הקודמים שלנו, שבהם המודל של המוטציה וההדמיה הספיק כדי להסביר את ההשלכות של התפקוד.

דוגמה 1: מוטציה אחת שדווחה, D595V ב ErbB4¹³, הובילה לדילום מוגבר של ErbB4 ופוספורילציה¹⁴. הדמיה של מיקום המוטציה הייתה גורם קריטי בהבנת ההשפעות הפונקציונליות שנצפו: D595V התרחשה בהצלבה הסימטרית של הזרועות העמומות של האקטודומיין(איור 2א’). הזרועות הן בעיקר ארומטיות והידרופוביות, והחלפת חומצה אספרטית קוטבית על ידי ואלין צפויה להגדיל את האינטראקציות ההידרופוביות “דביקות”, לייצב את העמים ומכאן להגדיל את משך הזמן שבו phosphorylation^{מתרחש 14.} זו הייתה הפתעה בהתחלה למצוא אספרטה בכל זרוע, אבל במבט לאחור אפשר לחשוב על זה כמנגנון תזמון לפעילות, שבו שרשראות צד חומצה קוטבית להפחית את הזיקה ואת החיים של dimer שלם ולכן להגביל את פוספורילציה מתווכים קינאז ואיתות. החלפה על ידי valine לאחר מכן להסיר הגנה זו על ידי ייצוב נוסף של dimer ErbB4.

איור 2: מיקום של מוטציה מפעילה ErbB4 ומוטציות המייצרות קינאז מת ErbB4. (A) D595 (הפעלת מוטציה D595V) ממוקם על הזרועות הארומטיות / הידרופוביות dimeric של מודל ectodomain ErbB4; שותף הנשק על גורם גדילה מחייב; (שאריות סמוכות מוצגות כמקלות). (ב)ב ErbB4, G802 (השבתת מוטציה G802dup) עוזר ליצור את הכיס המחייב סביב טבעת אדנין של ATP וקטליה D861 (השבתת מוטציה D861Y) קושר הן Mg²⁺ (לא מוצג) ואת קבוצת γ-פוספט של ATP. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

דוגמה 2: ניתן לצפות כי מוטציות סומטיות המתמקדות באתר איגוד ATP של תחום kinase ישנה או לחסל פעילות אנזימטית המובילה קולטן לקוי או kinase מת אינו מסוגל לאותת. מתוך תשע מוטציות שדווחו מחולים עם שד, קיבה, המעי גס, או NSCLC¹⁵, שתיים מתוך תשע מוטציות כאשר נבדקו היו פעילות זרחן^{מופחתת מאוד 16}: G802dup (G → GG) ו D861Y. שתי מוטציות סומטיות השבתה נמצאו בתוך אתר איגוד ATP של מבנה תחום קינאז טירוסין(איור 2B):גליסין גמיש, משוכפל, ישנה את אתר טבעת אדנין וחומצה אספרטית קטנה הוחלף טירוסין מגושם ליד פוספטים מסוף היה מונע פיזית Mg²⁺-ATP מאיגוד. עם זאת, מאז ErbB4 יכול ליצור הטרודימר עם ErbB2 – ErbB2 אינו כבול גורם גדילה ותלוי בשיתוף עם ErbB כי עושה על מנת הטרודימר – ErbB2(פעיל)—- ErbB4 (kinase-מת) הטרודימר יעורר התפשטות תאים באמצעות מסלול איתות Erk / Akt עדיין תאים לא להבדיל בגלל קינאז מת ErbB4 וחוסר הפעלת מסלול STAT5¹⁶.

במחקרים עדכניים יותר, התברר כי התנועות הדינמיות של ErbBs היו רלוונטיים להבנת ההשפעות של כמה מוטציות על תפקוד ErbB, במיוחד מוטציות המתרחשות בתוך תחום קינאז טירוסין. תחום הקינאז טירוסין מורכב N-אונה (בעיקר β גיליונות) ו C-האונה (בעיקר אלפא helical), אשר מופרדים על ידי האתר הקטליטי שבו ATP נקשר. האונה כוללת את סליק αC ו-P-loop, בעוד שההפעלה (A-loop) ולולאות קתליטיות נמצאות ב-C-lobe¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. מבני גביש של תחום קינאז טירוסין חשפו שני קונפורמציות לא פעילות, רוב המבנים יש מצב לא פעיל כמו SRC. בהתאמה הפעילה, ההתלת הקטאליטית של ה-A-loop מצביעה על אתר איגוד ATP והסליל αC מונחה כלפי כיס הכריכה של ATP (“αC-in” conformation), ויוצר אינטראקציה חזקה של זוג יון גלוטמט-ליסין.

מכיוון ש-ErbBs ותחום הקינאז של הרכיב הם ישויות דינמיות ביותר, ובמיוחד במקרים שבהם ההשפעות של מוטציות על תפקוד ופעילות ביולוגית צפויות להיות קשורות בחוזקה ל מצבים הקונפורמיים של ה-ErbBs, חשוב להעריך מוטציות ביחס למגוון השינויים הדינמיים שהם יחוו. מבני גביש רנטגן של ErbBs מספקים תמונות סטטיות של מבנה תלת-מית-מיו, שעשויות להיות רלוונטיות או לא כדי להבין את ההשלכות הדינמיות של מוטציה. על מנת לבדוק את טווח השינויים הדינמיים המתאימים ל”נוף האנרגיה” הזמין למבנה תלת מימדי (תלת-ממדי), סימולציות דינמיקה מולקולרית (MD) נמצאות בשימוש^{נרחב 20}. במקרה של מוטציות שיובילו לשינויים קונפורמציה מקומיים בתוך תחום קינאז טירוסין או ייצוב של מורכב, סימולציות על סדר של 100 ns עשוי להיות מספיק. עם זאת, שינויים קונפורמיים בקנה מידה גדול יותר (לדוגמה, מעברים בין ההתאמות הפעילות ולא פעילות של תחום הקינאז) דורשים זמן סימולציה ארוך יותר – בסדר של^{מיקרו-שניות 21}.

ביחס לפרוטוקול המתואר להלן אנו שוקלים שתי מוטציות מפעילות בתוך תחום קינאז טירוסין(איור 3). שתי המוטציות ממוקמות בתוך תחום kinase במקומות החווים שינויים קונפורמיים מקומיים המכתיבים אם הקינאז פעיל או לא, ולכן סימולציות MD הוחלו בשני המקרים. במקרה הראשון, אנו שוקלים שינויים המשפיעים ישירות על אתר איגוד ATP ומכונות קטליה של תחום kinase מקלט EGFR, במיוחד לבחון את ההשלכות של מוטציה exon 19 מחיקה כי הוא מעורב נרחב NSCLC^4,^,⁷. מוטציה⁷⁴⁶ELREA^750, אשר מקטין את אורך לולאת β3-αC לפני סלילי αC – סלילי נע לכיוון האתר מחייב / פעיל על הפעלת kinase ומשתתף בגימת האינטראקציה האלקטרוסטטית הקריטית בין E762 של סליר K745 על ידי מיקום ליסין לאינטראקציה עם ATP – מונע את התחום^{להפעלה 12}. במקרה השני, אנו מחשיבים את מוטציה A702V של EGFR, מוצג להיות מוטציה חדשנית רווח-של פונקציה הפעלת גילה על ידי פלטפורמת iScream^{9 וזוהה} בחולה NSCLC²². אלנין-702 על תחום kinase מקלט ממוקם על קטע juxtamembrane B בממשק של המקלט ואת המתחומים kinase מפעיל, שבו זה אסימטרי kinase dimer מורכבים kinase שינויים קונפורמציה קינאז נדרשים להפעלה⁹.

איור 3: דימר תחום הקינאז האסימטרי של EGFR. מוטציה A702V יהיה ממוקם בממשק הקריטי של מפעיל ומקלט kinase תחומים, סמוך סליל αC וקרוב isoleucine 941 של kinase מפעיל. שינויים קונפורמיים המושרים על ידי היווצרות של דימר אסימטרי להוביל להפעלת קינאז. לולאת β3-αC המכילה את רצף ELREA מקדימה ישירות את סליל αC; במהלך ההפעלה, סליר αC נע פנימה לכיוון אתר איגוד ATP. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

הערה: הצעדים המפורטים שננקטו כדי לבחון את ההשפעות של מוטציית ΑELREA ו- A702V על מבנה EGFR באמצעות סימולציות MD נדונים כדלקמן: 1. הכנת מבנה הערה: על מנת ללמוד את ההשפעות המבניות של מוטציה 3ELREA, צורות מסוג בר ומוטנטים של apo פעיל, ATP מחויב פעיל apo לא פעיל EGFR מבני מונומר מוכנים כדלקמן. פתח את תוכנית ההדמיהשל כימרה23 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/)להכנת מבנה הקינאז הפעיל של ה-APO מסוג פראי. בתפריט קובץ לחץ על האפשרות הבאת על-ידי מזהה ובחר את מסד הנתונים של בנק נתוני חלבון (PDB24) וציין קוד PDB 2GS225 (רזולוציה של 2.8 Å). PDB הוא מאגר למבנים תלת-מיוד שנפתרו על ידי טכניקות ניסיוניות שונות, כולל קריסטלוגרפיה רנטגן, ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית, מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים וiffraction ניוטרונים. בנה את הרכיבים המבניים החסרים של 2GS2 על-ידי לקיחת מקטעים אלה ממבני EGFR PDB 1M1426 (2.6 Å) ו- 3W2S27 (1.9 Å). לשם כך, פתח את 1M14 ו- 3W2S והצב אותם על 2GS2 באמצעות האפשרות MatchMaker בתפריט השוואת → כלי. חתוך את המקטעים שיש להוסיף מ- 1M14 ו- 3W2S. בחר את אטומי המסוף של השאריות לפני הפערים ב- 2GS2 ואת האטומים שיש להוסיף מ- 1M14 ו- 3W2S (לקבלת מידע מפורט על המקטעים שנוספו, ראה טבלה 1). בשורת הפקודה סוג בונד סל ולחץ על enter. מבנה זה הוא מבנה התבניות. השתמש במבנה התבנית בשלב 1.2 כדי לבנות את הצורה המוטנטית למחיקה של קבוצת המחשבים קינאז EGFR. הפק את רצף הפורמט FASTA של EGFR באופן מהיר על-ידי שמירת הרצף של מבנה התבנית (קובץ → מועדף → קובץ → שמירהבשם ) ולאחר מכן מחיקת רצף ELREA במספרים שאריות 746-750. פתחו את רצף EGFR של EGFR ב-Chimera ויישרו אותו עם הרצף של מבנה התבנית 2GS2 באמצעות תפריט רצף. בחלון היישור בחר באפשרות מבנה → (הומולוגיה)28. בחלון המוקפץ ציין את המבנה המורכב 2GS2 כתבנית ואת רצף מוטציה כשאילתה שיש לדגמן. לאחר מכן לחץ על אישור. בחר מודל מוטציה בין הדגמים המתווברים, בהתבסס על הציון zDOPE (בדרך כלל הציון הנמוך ביותר) ובדיקה חזותית. כדי להכין את מבנה הקינאז EGFR מסוג פראי המאוגד ב-ATP, השתמש במבנה PDB 2ITX29 (2.98 Å) כמבנה הראשי. בנה מקטעים חסרים (ראה טבלה 1)באמצעות המבנים 2GS625 (2.6 Å) ו- 3W2S לאחר ההליך בשלב 1.2. המר את ה-ANP של ליגנד במבנה שנוצר ל- ATP על-ידי פתיחת קובץ PDB בעורך טקסט ושינוי אטום החנקן N3B של ANP לאטום חמצן. פתח את המבנה בשלב 1.4 בקימרה כאמור בשלב 1.1. הוסף יון מגנזיום למבנה זה ממבנה PDB 2ITN29 (2.47 Å) כדי להשיג מיקום דומה עבור יוןMg 2+ . עם המבנה הנובע שלב 1.5, דגם את הטופס מוטציה ThELREA בעקבות שלב 1.3. Apo פעיל EGFR Apo לא פעיל EGFR EGFR פעיל מאוגד ATP מבנה ראשי 2GS2 (2GS2) 2GS7 (2GS7) 2ITX (2000) מבנים המשמשים לבניית לולאות חסרות 1M14 (723-725) 3W2S (958-984) 2GS6 (862-865) 3W2S (967-981) ג’ון שנוה 3W2S (990-1001) טבלה 1: מבנים המשמשים לבניית מודלים מורכבים של מבנים פעילים פעילים של apo, apo לא פעילים ומבנים פעילים מאוגדים ATP. אזורים חסרים (טווח חומצות אמינו בסוגריים) במבנה הראשי נבנו מהמבנים המפורטים. כדי להכין את מבנה הקינאז EGFR הלא פעיל מסוג פראי, פתח את מבנה PDB 2GS725 (2.6 Å) כמו בשלב 1.1 ומחק את הליגנדים המאוגדים ואת המים הגבישיים. הוסף את המקטעים החסרים ב- 2GS7 (ראה טבלה 1)ממבנים 3W2S ו- 4HJO30 (2.75 Å) באמצעות ההליך בשלב 1.2. בהתבסס על מבנה EGFR הלא פעיל הסופי, הכן את מודל המוטנטים באמצעות ההליך בשלב 1.3.הערה: עבור מחקר מוטציה A702V, מבנה דימר אסימטרי EGFR נחקר כמו המוטציה ממוקם במקטע juxtamembrane B של תחום kinase המהווה חלק גדול של ממשק dimer. מבני EGFR מוטציה מסוג פראי ו-A702V מוכנים באופן הבא: מבנה דימר אסימטרי מסוג פראי בנוי ממבנה PDB 2GS2, אשר מוצג בתחילה בצורה מונומרית. כדי להמיר להרכבה הביולוגית המכילה את kinases מפעיל מקלט בסידור אסימטרי, לפתוח 2GS2 ב Chimera כמו (1.1) ולבצע חישובי סימטריה על-ידי לחיצה על כלים → מבנה סדר גבוה יותר → תא יחידה. בחר את מבנה 2GS2 והזן הזן הזמן עותקים. לבסוף, בחר ושמור דימר אסימטרי יחיד מהעותקים המרובים של dimer הנובעים מפעולות הסימטריה. באמצעות מבנה EGFR אסימטרי מסוג פראי מ- 1.8, בנה את מוטציה A702V על-ידי החלפת אלנין 702 עם קו באמצעות כלי → מבנה עריכה → Rotamers אפשרות כימרה.הערה: יחד, שישה מבני EGFR מונומריים ושני מבני EGFR דימריים מוכנים ללימודי מוטציה 3302V, בהתאמה. כל מבנה מעובד לאחר מכן לסימולציה באמצעות אשף הכנת החלבון בתוכנית Maestro31 וסימולציות MD נעשות עם תוכנית אמבר32. פתח את המבנה ב- Maestro באמצעות האפשרות → קובץ וייבוא. לאחר מכן לחץ על כפתור אשף הכנת החלבון ובחר את האפשרויות הבאות: להוסיף אטומי מימן, לבנות אטומים בצד שרשרת חסר, לקבוע מצבי פרוטונציה של שאריות יוניון ב pH 7.0 באמצעות PROPKA, לייעל את הכיוון של אספז’ין, גלוטמין ושאריות היסטדין עבור מליטה מימן, ולבסוף למזער את המבנה. 2. הגדרת המערכת פתח את תוכנית הקפיצה הכלולה בחבילת התוכנה Amber. ייבוא שדה כוח ff14SB33 (מקור leaprc.protein.ff14SB) ומולקולות מים TIP3P34 (מקור leaprc.water.tip3p). עבור מערכות מאוגד ATP גם לייבא פרמטרים עבור ATP35 (loadamberparams frcmod.phosphate, loadamberprep ATP.prep). לאחר מכן, לטעון את המבנה (mol = loadpdb structure.pdb). לחלף את המבנה בקופסת אוקטהדרל עם מולקולות מים TIP3P מפורשות המשתרע 10 Å בכל הכיוונים מן אטומי פני השטח של החלבון (solvateoct mol TIP3PBOX 10.0). בדקו את המערכתהבנויה (Check mol)וננטרלו אותה על ידי הוספת יונים נחוצים(תוספות מול Na+ 0). כדי מודל מספיק מערכות ביומולקולרי, להוסיף נוסף Na+/ Cl- אטומים לתיב הסימולציה כדי להביא את ריכוז מלח המערכת 0.15 M (addions mol Na + X, addions mol Cl-X), שם X מוחלף על ידי התוצאה של: ריכוז מלח רצוי * מספר מולקולות מים * נפח לכל מולקולת מים * המספר של אבוגדרו. צור ולשמור את הטופולוגיה ולתאם קבצים של המערכת, אשר משמשים תשומות עבור סימולצית הייצור הבא (saveamberparm mol X.prmtop X.inpcrd). 3. הדמיית דינמיקה מולקולרית באמצעות אמבר, בתחילה לחשוף את מערכת הסימולציה 5000 מחזורים של ירידה תלולה ולזיוות מזעור אנרגיה הדרגתית כדי לעקוף תצורות שליליות. לבצע את מזעור בשלבים מרובים, בהדרגה להוריד את האיפוק מוחל על אטומים solute מ 25 קק”ל מול-1 Å -2 כדי 0 קק”ל מול-1 Å-2. בקובץ קלט מזעור, min.in, להתאים את משתנה maxcyc עבור מחזור מזעור הכולל (maxcyc = 5000) ו ncyc כדי למדינה את מספר המחזורים עבור אלגוריתם הירידה התלול ביותר. השתמש במשתנה restraint_wt כדי להחיל את כוח הריסון על אטומים סולים שצוינו על-ידי הפרמטר restraintmask. לאחר מכן הפעל את מזעור כדלקמן:$AMBERHOME/סל/סנדר -O -אני min.in -o min.out -p X.prmtop -c X.inpcrd -r min.rst -ref X.inpcrdהערה: האסטרטגיה והפרמטרים בפועל המשמשים עשויים להשתנות בהתאם להעדפותיו של האדם עצמו. פרטים והדרכה ניתן למצוא מהמדריך ואתר האינטרנט של אמבר (https://ambermd.org/index.php) מחממים את המערכת ל-100 ps מ-0 K עד 300 K ומכינים 10 קק”למול -1 Å-2 באיפוק על אטומי סוליה. כך, הגדר tempi = 0.0, temp0 = 300.0, dt = 0.002 ps, nstlim = 50000 ו- restraint_wt = 10 בקובץ heat.in ה- heat.in. לבצע את החימום באמצעות הפקודה הבאה:$AMBERHOME/סל/סנדר -O -i -heat.in -o heat.out -p X.prmtop -c min.rst -r heat.rst -x heat.mdcrd -ref min.rst לצייד את המערכת עבור 900 ps תחת הרכב NPT; מספר קבוע של אטומים, טמפרטורה (temp0 = 300.0) ולחץ (ntp = 1), שליטה בו עם השיטה Berendsen (ntt = 1). הגדר ניתוק מרחק 9 Å (לחתוך = 9.0) עבור אינטראקציות אלקטרוסטטיות לטווח ארוך. הנמך בהדרגה את איפוק האטום של ה-solute ל- 0.1 קק”למול -1 Å-2 (restraint_wt = 0.1). הפעל את קובץ קלט equil.in המתאר את הפרמטרים לעיל כדלקמן:$AMBERHOME/סל/סנדר -O -i -equil.in -o equil.out -p X.prmtop -c heat.rst -r equil.rst -x equil.mdcrd -ref heat.rst לסיים את שיווי המשקל עם סימולציה בלתי מרוסנת של 5 ns (להגדיר dt = 0.002 ps, ntslim = 2500000).$AMBERHOME/סל/סנדר -O -i equil_final.in-o equil_final.out -p X.prmtop -c equil.rst -r equil_final.rst -x equil_final.mdcrd -ref equil.rst ודא כי המערכת יש equilibrated על ידי בדיקת הטמפרטורה, לחץ, צפיפות וערכי אנרגיה.$AMBERHOME/סל/process_mdout.perl חום.החוצה equil.out equil_final.outסיכום אקסמגריס. טמפרטורה/ צפיפות /תות/EPTOT/EKTOT לבצע את הדמיית הייצור עבור 100 ns (להגדיר dt = 0.002 ps, ntslim = 50000000 ב prod.in) ולשמור conformations כל 10 ps (ntwx = 5000).$AMBERHOME/סל/סנדר -O -i prod.in -o prod.out -p X.prmtop -c equil_final.rst -r prod.rst -x prod.mdrcd -ref equil_final.rst 4. ניתוח בדיקה חזותית דמיין את הקונפורמציות שנדגמו במהלך סימולציות קינאז EGFR מסוג פראי ומוטנט על-ידי פתיחת קבצי הטופולוגיה של ענבר X.prmtop וקבצי המסלול המתאים prod.mdcrd ב- VMD36. באמצעות ייצוגי מבנה משני נוחים, לנתח את הדינמיקה המבנית הכוללת של החלבונים מהמסלול המוקלט. הצג אינטראקציות ספציפיות בין אטומים/שאריות עניין, כגון K745 – E762 גשר מלח חיוני מבחינה קתלית. לחלופין, שמור קונפורמציות מרובות שנדגמו במהלך הסימולציה בפורמט PDB ולפתוח אותם באמצעות תוכנית כימרה. הכן את המבנים במבנה הראשוני או החציוןי באמצעות האפשרות MatchMaker. הצג את המבנה הראשוני/חציון במבנה מלא ואת שאר המבנים המיושרים בלבן דהוי. גישה זו מאפשרת לדמיין את התנועות המבניות שהוקלטו בבהירות רבה יותר.הערה: ניתן למצוא במלווין ואח’ הצעות לייצוגים יעילים ולעיבודהרכבים קונפורמיים מ-MDS. ניתוח RMSD ו- RMSF חישוב שורש-ממוצע סטייה מרובעת (RMSD) ותנודות מרובעות ממוצעות שורש (RMSF) חישובים עם תוכנית Cpptraj 38 כדי לנתח את היציבות הגלובלית של החלבונים ולבחון את הגמישות של יחידות מבניות שונות. בקבצי rmsd.in rmsf.in, ציין את אטומי עמוד השדרה (עבור RMSD) ואת אטומי Cα (עבור RMSF) של המבנה הראשוני כהפניה עבור התאמת RMS. בקבצי rmsd/rmsf.in לייבא את קבצי טופולוגיית ענבר (parm X.promtop) ואת קבצי המסלול המתאימים(trajin prod.mdcrd). לאחר מכן הפעל את הפקודה Cpptraj -i rmsd/rmsf.in. התווה את נתוני הפלט לניתוח. לחלופין, ליישר הרכבים קונפורמציה וצבע כל שאריות המבוססות על RMSD אטום Cα. כך, פתחו את הקונפורמציות בקימרה ויישרו אותם עם האפשרות ‘דכן’. עבור אל כלים → תיאור → לפי תכונה. בחר שאריות של ההרכב הקונפורמציה ו- Cα RMSD כתכונות ולחץ על אישור. לאחר מכן, עקבות השרשרת של הקונפורמציות יהיו צבועות מכחול → לבן →, בהתאמה, המשקפות אזורים של יציבות מבנית גבוהה, בינונית ונמוכות. ניתוח אג”ח מימן נתח את האינטראקציה של קשר מימן בין ATP לבין EGFRs מסוג פראי/3ELREA. הכן סקריפט Cpptraj, hbond.in, כדי לבצע משימה זו. הגדר קשר מימן עם מרחק מקבל תורם של פחות או שווה ל- 3.5 Å וזווית קשר של גדול או שווה ל- 135°. פרט ניתוח רק עבור איגרות חוב מימן בין-מולקולריות עם משתנה nointramol כלומר איגרות חוב מימן בין ATP ו EGFR (hbond כל nointramol dist 3.5 החוצה nhb.agr avgout avghb.dat). הפעל את התסריט כמו Cpptraj -i hbond.in. השתמש בקובץ Script זה כדי להעריך אינטראקציות פנים מולקולריות, למשל בין שאריות K745 ו- E762, שהן שאריות מפתח עבור פעילות קינאז EGFR. כך, ציין את K745 כתורם אג”ח מימן ו- E762 כמקבל אג”ח מימן hbond.in ולהפעיל את התסריט בהתאם. ניטור מרחק בין אטומים מדוד את המרחק בין K745 ל-E762 על-ידי פתיחת המסלולים של EGFRs מסוג פראי ו- ΑELREA apo EGFRs ב- VMD. בחר את Cơ של Glu762 ו Nz של Lys745 על-ידי לחיצה על → העכבר → ותווית. נטר את המרחק במהלך הסימולציה על-ידי התוויית גרף עם תוויות → גרפיות → גרף →. חישובי אנרגיה חופשית כדי לחשב את האנרגיות המשוערות של איגוד חופשי בין ATP לבין סוג פראי/ERELREA EGFRs, ובין kinases מפעיל מקלט של סוג פראי / A702V EGFRs, השתמש במכניקה המולקולרית כלליבורן שטח פנים (MM-GBSA)מודול 39 זמין בחבילת AMBER. הגדר ATP כמו הליגנד ו EGFR כקולטן במחקר ΑELREA. במחקר A702V, ציין קינאז מקלט כמו הליגנד ואת kinase מפעיל כקולטן. תחילה להכין את ליגנד, קולטן וקבצי PDB קומפלקס קולטן ליגנד בנפרד בתוכנית הקפיצה הגדרת הערך PBRadii mbondi2. עבור קבצי PDB, שמור את טופולוגיית ענבר שלב הגז ( .prmtop) ולתאם ( .inpcrd) קבצים. לאחר מכן, בקובץ הקלט mmgbsa, mmgbsa.in, הגדר igb = 2, saltcon = 0.1. בצע חישובי אנרגיה מחייבים באמצעות המסלולים של הסימולציות, קבצי ענבר קולטן /ליגנד מוכן ואת הפרמטרים ב- mmgbsa.in עם MMPBSA.py זמין ענבר כדלקמן:$AMBERHOME/bin/MMPBSA.py -o -i mmgbsa.in -o mmgbsa.dat -sp X.prmtop -cp complex.prmtop -rp קולטן.prmtop -lp ליגנד.פמטופ -y prod.mdcrd -eo output.csv נתח את נתוני הפלט, output.csv, על-ידי התוויית גרפים.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר שימש כדי ללמוד את ההשפעות המבניות של מוטציות ΑELREA ו A702V על מבנה קינאז EGFR. יישום אחד של הפרוטוקול היה לחקור את ההשפעה של המוטציות על יציבות מבנית/קונפורמציה מקומית על ידי חישוב ערכי RMSD ו- RMSF מסימולציות MD. כמו מוטציה A702V ממוקם במקטע juxtamemembrane B, RMSD של קטע זה של kinase מקלט ביחס למבנה ההתחלתי חושב הן עבור סוג פראי A702V EGFRs. התוצאה (איור 4A) חשפה כי קטע juxtramembrane B של המוטנט הגדיל את היציבות הקונפורמציה במהלך סימולציה 100 ns (ממוצע RMSD 0.7 Å – Å מרווח ביטחון של 95% (CI) 0.009) בהשוואה לתחום הקינאז EGFR מסוג פראי (ממוצע RMSD 1.1 Å – 95% CI 0.01). סביר להניח כי זוהי תוצאה של אינטראקציות הידרופוביות הדוקות יותר בממשק dimer עקב החלפת אלנין 702 (שרשרת צד קבוצת מתיל) למשקע הידרופובי מגושם יותר, ואלין (שרשרת צד קבוצת isopropyl), המוביל אינטראקציות הידרופוביות מוגברת של V702 על תחום kinase מקלט עם isoleucine 941 של תחום קינאז מפעיל. מוטציה ΑELREA ממוקם בלולאה β3-αC, סמוך סליל αC קריטי מבחינה פונקציונלית; ההתאמה של סלילי αC היא המפתח לשינויים בין מצבים פעילים ולא פעילים של קינאז EGFR. היציבות הקונפורמציה של סלילי αC במצב הפעיל הוערכה על ידי בדיקת RMSF מעל אטומי Cα של שאריות בתוך סלילי במהלך סימולציות MD(איור 4B):בסך הכל, יש תנודות נמוכות יותר במוטציה (ממוצע RMSF 1.1 Å – 95% CI 0.4) בהשוואה לסוג הפראי (ממוצע RMSF 1.5 Å – 95% CI 0.57); עם ההפרש הגבוה ביותר בתנודות שנרשמו עבור שאריות N-terminal. הקונפורמציות שנדגמו בהתאמה על המבנה החציוני של תחום kinase מסוג פראי של תחום kinase 3 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000Figure 4C ממצאים אלה מצביעים על כך שמוחק רצף ELREA מרסן את תנועת סליל αC של המדינה הפעילה, ומכאן ריסון ובכך ייצוב הקונפורמציה הפעילה. יתר על כן, מאז סליק αC מהווה חלק ממשק dimer אסימטרי, המגבלות על סליר αC בmutant סביר מאוד לייצב את dimer אסימטרי, הארכת משך של המצב מופעל. יישום נוסף של הפרוטוקול הוא לחקור את ההתנהגות של אינטראקציות פנים-מולקולריות מפתח המתרחשות במהלך הסימולציה. לכן, האינטראקציה בין K745 ו E762, שהוא בסיסי לפעילות אנזימטית EGFR, נותח הן עבור הצורה הפעילה מסוג פראי והן עבור קינאז EGFR של EGFR על ידי מדידת התפוסה באחוזים של קשרי מימן שנוצרו בין אטומי הקוטב של שתי השאריות במהלך סימולציות MD (איור ( איור 5A): אינטראקציה אלקטרוסטטית מרכזית זו נוצרה לעתים קרובות יותר בתחום קינאז ΑELREA בהשוואה לתחום kinase מסוג פראי, בשל סליל αC יציב יותר התואם E762. האינטראקציות בין Mg2+-ATP לבין התחומים מסוג פראי ו-EGFR (איור 5ב’) במהלך הסימולציה הוערכוגם (איור 5ג’):מספר איגרות החוב של המימן היה גדול יותר עבור 3ELREA (ערך ממוצע 4.0 – 95% CI 0.03) מאשר עבור EGFR מסוג פראי (ערך ממוצע 3.2 – 95% CI 0.04). ניתוח נוסף של איגרות החוב מימן גילה כי K745 אינטראקציה בתדירות גבוהה יותר עם קבוצות פוספט של ATP ב EGFR EGFR, אשר מקושר לאינטראקציה יציבה יותר K745-E762 ציין בסימולציה של תחום קינאז מוטציה EGFR EGFR. סימולציות MD כמתואר בפרוטוקול שימושיות גם בהערכת האנרגיה החופשית היחסית של קשירה לאינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-ליגנד. האנרגיות המחייבות בין מפעיל ומקלט קינאז תחומים של סוג פראי ו- A702V EGFRs, ובין ATP ואת סוג פראי ו EGFR מוטציה EGFR kinase תחומים, היו מחושבים מן המכניקה המולקולרית כללי נולד שטח הפניםbind (MMGBSA) חישובים (איור 6A): מוטציה A702V הפיק ערך איגוד ממוצע נמוך יותר (איגוד 3G ממוצע = -76 קק”ל / מול – ערך 95% CI 0.47), המייצג אינטראקציות dimer חביבות יותר, בניגוד לתחום EGFR מסוג פראי (איגוד ממוצע 3G = -61 קק”ל/מול – 95% CI 0.61).bind bind תצפית זו עולה בקנה אחד עם קטע juxtamembrane B יציב יותר ממשק dimer הדוק יותר בשל אינטראקציות הידרופוביות מוגברת שנצפו עבור תחום קינאז EGFR A702V. במקרה של איגוד ATP לתחומים מסוג פראי ו- EGFR קינאז(איור 6ב’),חישובי MMGBSA מנבאים איגוד ATP חזק יותר עם מוטציה ת”א (איגוד ממוצעשל EgG -5 7 קק”ל/מול – 95% CI 0.43) בהשוואה ל-EGFR מסוג פראי (איגוד ממוצעשל 38 קק”ל/מול – 95% CI 0.33). תוצאה זו עומדת בקנה אחד עם המספר הגדול יותר של איגרות חוב מימן שנרשמו בין ATP ו- EGFR (איור 5C) בהשוואה לתחום מסוג פראי. הפרוטוקול יכול גם להיות מועסק כדי לחקור שינויים קונפורמציה שנצפו במהלך סימולציה. במחקר הנוכחי, ההשפעות של מוטציית EGFR הלא פעילה נחקרו על ידי בדיקה חזותית ומיקום על של הקונפורמציות שנדגמו מהסימולציה. הניתוח חשף תנועה פנימית של סליל αC בתחום קינאז EGFR ΑELREA (איור 7A), שינוי מבני הצפוי במהלך המעבר למצב הפעיל. In contrast, the αC helix of wild-type inactive EGFR maintained its initial conformation (Figure 7B). לפיכך, סימולציות MD תומכות בהצעה כי מוטציית המחיקה, המוצגתבאופן ניסיוני כדי להגדילאת פעילות kinase 40,41, מקדמת שינוי קונפורמציה מן kinase לא פעיל כלפי המצב הפעיל. איור 4: יציבות קונפורמציה מסוג פראי ומוטנטי של תחום הקינאז הפעיל EGFR במהלך הדמיות MD. (A) RMSD (אטומי עמוד שדרה) מעל מקטע juxtamembrane B של סוג פראי (כחול) ו- A702V (אדום) מקלט kinase תחום. (ב)RMSF (אטומי Cα) על שאריות של סליל αC: סוג פראי (כחול) ו- ΑELREA (זהב). (ג)קונפורמציות שנדגמו על-ידי סוג פראי (משמאל) ו- EGFR kinase (מימין) ; עקבות שרשרת צבעוניות המבוססות על RMSD (אטומי Cα) של כל שאריות ביחס למבנה החציוני. צביעה נעה בין כחול ללבן לאדום, המייצג אזורים של יציבות קונפורמציה גבוהה עד נמוכה. שים לב כי האזורים “חינם” N-מסוף של תחום kinase מבודד, אדום צבעוני, לא יציג רמה זו של ניידות במבנה EGFR שלם. נתונים מותאמים מתוך Chakroborty ואח ‘9 (איור 4א שוחזר באישור כתב העת לכימיה ביולוגית) ו תמירת ואח’12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: תכונות מפתח שנראו קינאז מקלט פעיל במהלך סימולציות MD: K745-E762 גשר מלח, סלילי αC ואינטראקציות עם ATP. (א)תפוסת אחוזים של האינטראקציה K745-E762 במהלך הסימולציה של סוג פראי (כחול) ו EGFR (זהב) EGFR קינאז תחומים. (ב)שאריות של סוג פראי ומוטנט ים-100 אינטראקציה עם ATP (מקלות). Mg2+ (ירוק) קואורדינטות עם ATP ו- D855. (ג)מספר איגרות החוב של מימן שנוצרו על ידי ATP הן עם סוג פראי והן עם תחומים קינאז EGFR מסוג פראי במהלך סימולציות MD. איור מאת תמירת ואח’12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 6: אנרגיות חופשיות יחסית נמוכות יותר של כריכה נצפו עבור תחומי קינאז מוטציה במהלך הסימולציות. (א)אנרגיות איגוד מחושבות עבור האינטראקציה בין המחשבים kinase מפעיל מקלט של סוג פראי (כחול) ו- A702V (אדום) EGFRs. (ב)איגודbind של ATP לתחומים מסוג פראי (כחול) ו- EGFR kinase מסוג פראי. נתונים מותאמים מ-Chakroborty ואח’9 (איור 6א’ שוחזר באישור כתב העת לכימיה ביולוגית) ותמיראטואח’ 12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 7: התאמות על-פי הסוג הפראי ותחום הקינאז הלא פעיל של EGFR. התאמה של סליל αC וסליל לולאה של (A) סוג בר (מבנה חציון בכחול) ו -(B)EGFRs ΡELREA (זהב). קונפורמציות אחרות שנדגמו, לבן דהוי; מבנים ראשוניים לפני סימולציות MD, ורוד. איור מאת תמירת ואח’12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

הפרוטוקול המתואר במחקר זה מתמקד בשימוש בסימולציות דינמיקה מולקולרית כדי לחקור שינויים מבניים מקומיים וגלובליים הנובעים מהפעלת מוטציות סומטיות של תחום קינאז EGFR. למרות מבני גביש רנטגן של סוג בר ומוטנט EGFRs לספק תובנה מבנית רבת ערך, הם מתארים אחד או כמה ייצוגים סטטיים. עם זאת, הטבוע בתפקוד הביולוגי של ErbBs הוא המעברים הדרושים בין kinase טירוסין פעיל אנזימטית פעיל, הפעלת שינויים דינמיים הן במבנה אינטראקציות פנים מולקולקולרי בין מונומרים קינאז. סימולציות MD בוצעו כך כדי לחקור את האופי הדינמי של תחום הקינז טירוסין EGFR, כולל מבנה מסוג בר, מוטציה המחיקה 3 002V הציג, ואת מוטציה A702V. סימולציות אלה הצליחו בהדרת התפקיד הסביר של מוטציות אלה במבנים ואיך ההשפעות שלהם על ההתאמה של תחום קינאז טירוסין יובילו לעליות שנצפו באופן ניסיוני בפעילות קינאז EGFR.

צעד מכריע בפרוטוקול זה הוא השימוש במבנה רלוונטי כדי להעריך את ההשפעה של המוטציה. דרך אחת לבחור מבנה קלט סימולציה רלוונטי היא לדמיין את המיקום של המוטציה במבנה 3D סטטי ולבחון את ההשפעה האפשרית שלה ביחס חומצות אמינו השכנות ויחידות מבניות. במחקר זה, למשל, מאז מוטציה A702V EGFR ממוקם במקטע juxtamembrane B שיוצר את ממשק dimer אסימטרי, השימוש במבנה dimer עבור הסימולציה בניגוד מונומר הוא קריטי. השימוש במבנה מונומרי היה חשף את קטע juxtamembrane B של kinase מקלט לממס, מניעתו מן האינטראקציות ייצוב, משופר על ידי המוטציה שאריות הידרופוביות גדול יותר ואינטראקציות עם isoleucine 941 מssicdues c-אונה של kinase מפעיל. יתר על כן, ראוי לציין כי המבנה 3D המיוצג על ידי הקואורדינטות בקובץ PDB אינם בהכרח תואמים את המבנה הרלוונטי ביולוגית שיש להשתמש בו למחקר. לדוגמה, עם המבנה של ErbB4, קוד PDB 3BCE, קואורדינטות PDB תואמות לטרימר, אך הסיבה לכך היא אנשי קשר גבישיים (מעט אנשי קשר בין המונומרים נראים בעת צפייה חזותית של מבנה זה). ניתן להשתמש במטריצות בתוך קובץ PDB (לדוגמה, בתוך כימרה) כדי לשחזר את המבנים הקשורים גבישי, אשר ניתן לדמיין כדי לזהות שרשראות התואמות למבנה 3D הרלוונטי ביולוגית כפי שדווח בפרסום המקורי⁴². שלב חיוני נוסף של הפרוטוקול הוא להכין כראוי את מבנה קלט הסימולציה, כגון בניית חומצות אמינו חסרות באזורי לולאה שונים, ובמיוחד היכן ממוקם בקרבת המוטציה. למרות שמבני EGFR רבים מסוג פראי קיימים ב-PDB, רק מספר מוגבל של מבני EGFR מוטנטים זמינים. כתוצאה מכך, המבנים המוטנטים גם צריכים להיות מודל; עבור מוטציה משקע יחיד כמו A702V, כימרה שימשה כדי mutmut את השאריות; בעוד שלמוטציה של המחיקה של 300 00:00:00,000 ——————————-

הפרמטרים השונים המנוצלים בקבצי קלט הסימולציה – לדוגמה, מספר מחזורי מזעור, חימום המערכת לטמפרטורה הרצויה בדרך אחת או במקום חימום איטי באמצעות מספר טמפרטורות ביניים, פרק הזמן לשיווי המשקל ולסימולציות הייצור – ניתן לשנות בהתבסס על מולקולת המחקר, מטרת העבודה וההעדפות של האדם עצמו. בעת ביצוע סימולציות MD, זה גם נפוץ להיתקל בשגיאות שיכולות לנבוע מקבצי הקלט, בעיות הקשורות תוכנת הסימולציה בשימוש או אפילו שגיאת משתמש. לפיכך, חשוב מאוד להבין את מקור השגיאות על ידי בחינה קפדנית של הודעות שגיאה. רוב תוכניות הסימולציה כוללות רשימת דיוור שבה משתמשים יכולים להציב שאלות למפתחי התוכנה ולאנשים אחרים שלעובריהם ניתן לפתור את רוב הבעיות. בנוסף, מדריכי משתמשים מספקים סיוע משמעותי להבנת פרטי פרוטוקול הסימולציה, כולל הנחות ומגבלות. למרות סימולציה MD הוא כלי חשוב כדי לחקור את המאפיינים הדינמיים של מולקולות, לזכור כי תוצאות חישוביות צריך להיות מוערך בקפידה בשילוב עם מקורות אחרים של מידע כדי להעריך את תוקפם. במידת האפשר, לעבוד יחד עם חוקרים כי הם מומחים על החלבונים במחקר, במיוחד שבו מחקרים ניסיוניים מעבדה רטובה רלוונטית נעשות, אשר משמשים כדי לספק תוצאות עבור פרשנות מבנית, כמו גם להציע ניסויים שעשויים להיעשות בהתבסס על תצפיות מבניות כדי לבדוק השערות.

במחקר זה, הפרוטוקול היה יעיל בבדיקת ההשפעות המבניות הדינמיות של מוטציות EGELREA ו- A702V על מבני קינאז EGFR. הסימולציות חשפו כי ΑELREA מרסן את סליל αC חיוני מבחינה פונקציונלית ומקדם שינוי קונפורמציה מהקין הלא פעיל לקינאז פעיל מיוצב. תוצאות הסימולציה נתמכות באופן עצמאי על ידי נתוני תגובה לתרופות שהדגימו את ההשפעות של מעכבי קינאז טירוסין על קווי תא סרטן ריאות שיש מוטציה מחיקה EGFR מסוג פראי, שם עיכוב גדול יותר על ידי תרופות זיהוי קונפורמציה קינאז פעיל דווח עבור EGFR מסוג בר¹². עם מוטציה A702V, סימולציות MD מצביעות, בהשוואה לסוג הפראי, ייצוב מוגבר של ממשק kinase מקלט מפעיל, כמו גם זיקה גבוהה יותר של מפעיל מקלט kinase אחד לשני, יחד תמיכה תחזוקה של קונפורמציה מופעלת של קינאז EGFR. מוטציה A702V, ממוקם על קטע juxtamembrane B של kinase מקלט, יגביר אינטראקציות הידרופוביות עם kinase מפעיל, מתפקד כדי להאריך את משך המצב מופעל. מוטציה A702V תומך בהישרדות תאים בהיעדר גורם גדילה וזוהה בהקרנה במבחנה עבור מוטציות EGFR⁹.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה ממומן על ידי מענקים ל-M.S.J מהאקדמיה של פינלנד (308317, 320005), קרן סיגריד יוסליוס וטור, ג’ו ופנטי בורג קרן זיכרון, וK.E. מהאקדמיה של פינלנד (274728, 316796), הקרן לסרטן של פינלנד, ואת בית החולים המרכזי של אוניברסיטת טורקו. M.Z.T. ממומן על ידי רשת הדוקטורט Åbo Akademi של ביולוגיה מידע ומבנית. אנו מודים למרכז ה-IT של CSC למדע על משאבי המחשוב ועל ד”ר Jukka Lehtonen על תמיכת ה-IT תחת רשת הביו-אינפורמטיקה של פינלנד; ו-Biocenter פינלנד רשת תשתית ביולוגיה מבנית.

Materials

Amber software	University of California, San Francisco	Version 2018	Executable
Chimera program	Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco	Version 1.13.1	Executable
EGFR struture files	The Protein Data Bank		3D coordinates of EGFR structures
Maestro	Schrödinger LLC	Version 2018-3	Executable
Modeller program	The Andrej Šali Lab, Departments of Biopharmaceutical Sciences and Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco		Included in the Chimera program
VMD software	Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champaign	Version 1.9.3	Executable

Referencias

Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. Untangling the ErbB signalling network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 127-137 (2001).
Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Ferguson, K. M. The EGFR family: not so prototypical receptor tyrosine kinases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, a020768 (2014).
Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: From oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 2, 282-303 (2014).
Mishra, R., Hanker, A. B., Garrett, J. T. Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: Clinical implications. Oncotarget. 8, 114371-114392 (2017).
. cBioPortal for Cancer Genomics Available from: https://www.cbioportal.org (2020)
Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. New England Journal of Medicine. 350 (21), 2129-2139 (2004).
Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from “never smokers” and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
Chakroborty, D., et al. Unbiased in vitro screen for activating EGFR mutations. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9377-9389 (2019).
Leahy, D. J. Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGF/ErbB) Family of Receptors. Advances in Protein Chemistry. 68, 1-27 (2004).
Roskoski, R. ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors. Pharmacological Research. 87, 42-59 (2014).
Tamirat, M. Z., Koivu, M., Elenius, K., Johnson, M. S. Structural characterization of EGFR exon 19 deletion mutation using molecular dynamics simulation. PLoS ONE. 14 (9), e0222814 (2019).
Ding, L., et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature. 455, 1069-1075 (2008).
Kurppa, K. J., Denessiouk, K., Johnson, M. S., Elenius, K. Activating somatic ERBB4 mutations in non small-cell lung cancer. Oncogene. 35 (10), 1283-1291 (2016).
Soung, Y. H., et al. Somatic mutations of the ERBB4 kinase domain in human cancers. International Journal of Cancer. 118, 1426-1429 (2006).
Tvorogov, D., et al. Somatic mutations of ERBB4: selective loss-of-function phenotype affecting signal transduction pathways in cancer. Journal of Biological Chemistry. 284, 5582-5591 (2009).
Hubbard, S. R., Till, J. H. Protein tyrosine kinase structure and function. Annual Review of Biochemistry. 69 (1), 373-398 (2000).
Huse, M., Kuriyan, J. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109 (3), 275-282 (2002).
Jura, N., et al. Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms. Molecular Cell. 42, 9-22 (2011).
Karplus, M., Kuriyan, M., J, Molecular dynamics and protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (19), 6679-6685 (2005).
Shan, Y., Arkhipov, A., Kim, E. T., Pan, A. C., Shaw, D. E. Transitions to catalytically inactive conformations in EGFR kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (18), 7270-7275 (2013).
Reckamp, K. L., et al. A phase I trial to determine the optimal biological dose of celecoxib when combined with erlotinib in advanced non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 12 (11 Pt 1), 3381-3388 (2006).
Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
Zhang, X., Gureasko, J., Shen, K., Cole, P. A., Kuriyan, J. An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor. Cell. 125 (6), 1137-1149 (2006).
Stamos, J., Sliwkowski, M. X., Eigenbrot, C. Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46265-46272 (2002).
Sogabe, S., et al. Structure-Based Approach for the Discovery of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based EGFR T790M/L858R Mutant Inhibitors. ACS Medicinal Chemistry Letters. 4 (2), 201-205 (2013).
Sali, A., Blundell, T. L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. Journal of Molecular Biology. 234 (3), 779-815 (1993).
Yun, C. H., et al. Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity. Cancer Cell. 11 (3), 217-227 (2007).
Park, J. H., Liu, Y., Lemmon, M. A., Radhakrishnan, R. Erlotinib binds both inactive and active conformations of the EGFR tyrosine kinase domain. Biochemical Journal. 448 (3), 417-423 (2012).
. Release 2018-3: Maestro Available from: https://www.schrodinger.com/maestro (2018)
Case, D. A., et al. . AMBER 2018. , (2018).
Maier, J. A., Martinez, C., Kasavajhala, K., Wickstrom, L., Hauser, K. E., Simmerling, C. ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., Klein, M. L. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. Journal of Chemical Physics. 79 (2), 926-935 (1983).
Meagher, K. L., Redman, L. T., Carlson, H. A. Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field. Journal of Computational Chemistry. 24 (9), 1016-1025 (2003).
Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD: Visual molecular dynamics. Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).
Melvin, R. L., Salsbury, F. R. Visualizing ensembles in structural biology. Journal of Molecular Graphics and Modelling. 67, 44-53 (2016).
Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
Miller, B. R., et al. MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations. Journal of Chemical Theory and Computation. 8 (9), 3314-3321 (2012).
Guha, U., et al. Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of EGFR and KRAS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (37), 14112-14117 (2008).
Furuyama, K., et al. Sensitivity and kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 19 and others to EGFR-tyrosine kinase inhibitors. Cancer Science. 104 (5), 584-589 (2013).
Qiu, C., et al. Mechanism of Activation and Inhibition of the HER4/ErbB4 Kinase. Structure. 6 (3), 460-467 (2008).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Tamirat, M. Z., Kurppa, K. J., Elenius, K., Johnson, M. S. Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation. J. Vis. Exp. (159), e61125, doi:10.3791/61125 (2020).