Оценка окислительного стресса в биологических образцах с использованием анализа химически активных веществ тиобарбитуровой кислоты

Перекисное окисление липидов – это процесс, в котором свободные радикалы, такие как активные формы кислорода и активные формы азота, атакуют двойные связи углерод-углерод в липидах, процесс, который включает в себя абстрагирование водорода из углерода и вставку молекулы кислорода. Этот процесс приводит к смешиванию сложных продуктов, включая липидные пероксиловые радикалы и гидропероксиды в качестве первичных продуктов, а также малониальдегид (MDA) и 4-гидроксиноненал в качестве преобладающих вторичных ^{продуктов1}.

MDA широко используется в биомедицинских исследованиях в качестве маркера перекисного окисления липидов из-за его легкой реакции с тиобарбитуровой кислотой (TBA). Реакция приводит к образованию MDA-TBA2, сопряжения, которое поглощается в видимом спектре при 532 нм и производит красно-розовый ^цвет2. Другие молекулы, полученные в результате перекисного окисления липидов, помимо MDA, также могут реагировать с TBA и поглощать свет при 532 нм, способствуя общему сигналу поглощения, который измеряется. Аналогичным образом, MDA может реагировать с большинством других основных классов биомолекул, потенциально ограничивая его доступность для реакции с ^TBA3,4. Таким образом, этот традиционный анализ просто считается измеряющим «реакционноспособные вещества тиобарбитуровой кислоты» или ^TBARS5.

При правильном применении и интерпретации анализ TBARS обычно считается хорошим показателем общего уровня окислительного стресса в биологическом ^{образце6}. К сожалению, как задокументировано Хоубнасабджафари и другими, анализ TBARS часто проводится и интерпретируется таким образом, чтобы облегчить сомнительные выводы3,4,7,8,9,10,11. Причины этого коренятся главным образом в преаналитических переменных, связанных с выборкой, и отсутствии прочности анализа, что запрещает, казалось бы, незначительные изменения в протоколе анализа без существенных изменений в результатах анализа1,7,12,13.

Преаналитические переменные, связанные с обработкой и хранением биообразцев (например, плазма крови, временно хранящаяся при -20 °C)^14,15, могут оказать существенное влияние на результаты анализа ^TBARS16,17; Настолько, что результаты анализа TBARS не следует сравнивать в разных лабораториях, если это не оправдано явными межлабораторными аналитическими данными валидации. Эта рекомендация сродни тому, как обычно используются и интерпретируются западные пятна. Сравнение плотностей полос справедливо для внутри-блоттинговых и, возможно, внутрилабораторных исследований, но сравнение плотностей полос между лабораториями обычно считается некорректной практикой.

Некоторые исследователи предположили, что MDA, измеренный с помощью анализа TBARS, просто не соответствует аналитическим или клиническим критериям, требуемым для приемлемого биомаркера3,9,10,18,19. Действительно, если бы анализ не был разработан более 50 лет назад, он, вероятно, не получил бы широкого использования и молчаливой приемлемости, которые он имеет сегодня. Хотя существуют и другие анализы с большей аналитической чувствительностью, специфичностью и прочностью, используемые для определения окислительного стресса, анализ TBARS, основанный на поглощении при 532 нм, остается одним из наиболее часто используемых анализов для определения перекисного окисления ^{липидов20} и, следовательно, оценки окислительного стресса.

Анализ TBARS можно найти только в виде дорогостоящего набора (более 400 долларов США), в котором инструкция не дает подробной информации о большинстве концентраций используемых реагентов. Кроме того, предоставленные реагенты могут быть использованы только для одного эксперимента, потому что только одна колориметрическая стандартная кривая может быть сделана на комплект. Это может быть проблематично для исследователей, которые намерены определить уровни окисления в нескольких образцах в разные моменты времени, потому что одна и та же стандартная кривая не может использоваться несколько раз. Следовательно, для нескольких экспериментов необходимо приобрести несколько наборов. В настоящее время, если не приобретен дорогостоящий комплект, нет подробного протокола, доступного для выполнения анализа TBARS. Некоторые исследователи в прошлом расплывчато описывали, как выполнять анализ ^TBARS21,22, но ни полностью подробный протокол, ни всеобъемлющее видео о том, как проводить анализ TBARS без дорогостоящего комплекта, не доступны в литературе.

Здесь мы сообщаем о подробной, аналитически проверенной методологии для целей о том, как выполнить анализ TBARS простым, воспроизводимым и недорогим способом. Изменения в перекисном окислении липидов сыворотки крови человека, лизатов HepG2 и липопротеинов низкой плотности при лечении ионами Cu(II) демонстрируются в качестве иллюстративных применений для анализа TBARS. Результаты показывают, что этот анализ TBARS является последовательным и воспроизводимым на ежедневной основе.