В Utero Electroporation multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Маркеры для индивидуализации кортикальной мыши астроцитов

Астроциты играют многочисленные жизненно важные функции в развитии мозга и физиологии¹. Помимо своей роли в гемово-мозговой барьер, где они регулируют поглощение питательных веществ и кровоток, они активно способствуют формированию синапса и функции при производстве нейромодуляторов, которые могут изменить нейронной^{активности и поведения 2}. Кроме того, дисфункция астроцитов способствует различным неврологическим расстройствам³. Астроциты, расположенные в коре головного мозга, демонстрируют сложную морфологию, позволяющую широко контактировать с нейронными процессами. Эти контакты, необходимые для функции цепи, также контролируют морфогенез астроцитов и синаптогенез через белки клеточной адгезии^4. Нейробиологам нужны удобные и надежные инструменты для исследования развития астроцитов и морфогенеза в их неврологических моделях, представляющих интерес. Однако, из-за близкого аппозиции астроцитов к своим соседям и их равномерной трехмерной плитки, это сложно выделить корковых астроцитов и всесторонне оценить их морфологии с помощью иммуномаркеров.

В настоящее время две основные стратегии генной инженерии позволяют маркировать и индивидуализировать кортикальные астроциты на месте: разреженная активация репортера в трансгенных линиях мыши или соматический трансгенез с использованием электропорации плазмидов репортера. Первая стратегия опирается на разведение floxed репортер мыши линии с мышами, выражают неопровержимую форму Cre рекомбиназы активируется специально в астроцитов при доставке тамоксифена (например, Aldh1l1-CreERT2⁵). С этой стратегией связано несколько недостатков. Во-первых, разведение трансгенных мышей требует большого количества животных и несколько анализов, как правило, необходимы для определения надлежащей дозы тамоксифена, чтобы обеспечить адекватно разреженную маркировку корковых астроцитов. Анализ фенотипов корковой астроцитов в модели генетической мыши, представляющих интерес, потребует еще большего размножения и потребления мышей. Кроме того, в утробе матери тамоксифен инъекции, как известно, вмешиваться в parturition, что делает эту стратегию трудно применять к изучению ранних стадиях развития астроцитов. Электропорация ДНК In vivo является альтернативной стратегией, свободной от тамоксифена, которая опирается на минимальное количество животных^6. Выполненный либо на эмбриональных или послеродовых стадиях, этот подход состоит из инъекций плазмидов репортера в боковой желудочков грызунов следуют электрические импульсы, которые создают поры в клеточной мембране, что позволяет ДНК войти в клетки-предшественники, выстилающие желудочек. Впоследствии, репортер трансгены осуществляется электропотерированных плазмидов обрабатываются целевой клеточной техники и выразил⁷. Два метода электропорации были ранее описаны для обозначения корковой астроцитов мыши: 1) Постнатальная астроцитная маркировка электропорацией (PALE), которая опирается на электропорацию 1-2 одноцветных плазмид эписомальных репортеров на ранних послеродовых^{стадиях 4;} 2) Стратегия StarTrack основана на утеро-электропорации (IUE) нескольких одноцветных интегративных^{плазмиды репортера 8,9,10}. Хотя эти два метода эффективно этикетки PrA в коре головного мозга, они также представляют некоторые ограничения. В своей первоначальной версии, оба метода полагаются на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) промоутер диск выражение в астроцитов, которые могут смещения маркировки к радиальной глии, а также pial и реактивных астроцитов, которые выражают GFAP сильнее, чем нормальный отдых PrA^11,12. Что касается PALE, другие недостатки поздней стадии электропорации, которая предотвращает маркировку раннерожденных PrA (или тех, которые возникают из ранних delaminating прародителей) и анализ ранних стадиях развития астроглии, и использование эписомальных векторов, которые становятся разбавленных через последовательные деления во время массового^{распространения,}что PrA пройти в течение первой послеродовой недели¹³,¹⁴. В отличие от PALE, StarTrack основан на эмбриональной электропорации интегративных плазмидов репортера, которые позволяют отслеживать вклад эмбриональных и постнатальных прародителей в PrA. Обновленная схема StarTrack, опираясь на промоутер ubiquitin C (UbC-StarTrack) достигает более широкого выражения флуоресцентных репортеров как в нейронном, так и в глианом спуске (астроциты включены) нейронных прародителей^15,16,17. Однако в его нынешнем варианте реализация этого подхода является сложной, поскольку он опирается на эквимоляльную смесь из 12 различных плазмидов, выражаюющих шесть флуоресцентных белков (FP) с частичным возбуждением и спектрами выбросов.

Представлено здесь является простым в утробе матери электропорации основе многоцветной маркировки метод с использованием интегративных репортер конструкций обусловлен сильным и широко активным промоутер выделить корковых астроцитов¹⁴. Кроме того, легкий конвейер анализа изображений с использованием как лицензированного (например, Imaris), так и открытого доступа (Vaa3D^18,19,20)программного обеспечения для анализа изображений предоставляется сегменту территориального объема астроцитов и арборизации, соответственно. По сравнению с ранее описанными методами, эта стратегия опирается исключительно на 1-2 многоцветных интегративных трансгенов Multiaddressable генома интеграции цветовых маркеров (MAGIC маркеры или ММ²¹) направлены на цитоплазмы и (по желанию) ядерного отсека ячейки, выражение которого определяется синтетическим CAG промоутер состоит из^{цитомегаловируса}усилитель, курица β-actin промоутер, и кролик β Это позволяет маркировать и отслеживать корковые астроциты, от эмбриональных до поздних постнатальных стадий, независимо от экспрессии GFAP^14,23. Каждый из этих трансгенов несет следующие четыре различных FP: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP и tdTomato/mCherry, которые отображают минимальное спектральное перекрытие, которое можно легко обойти с приобретением 1) последовательного канала; 2) Оптимизированная сила возбуждения и увеличение сбора; и 3) Специфические дихроические фильтры для сбора узких окон выбросов FP. Стратегия MM используетрекомбинацию Cre/lox с самоизвестной рекомбиназой Cre (seCre) для привода стохастичного выражения FP в клеточной популяции. Одна копия MM transgene выражает FP взаимоисключающим образом, в то время как несколько трансгенов создают комбинации FP, создавая десятки различных оттенков. Геномная интеграция трансгенов определяется piggyBac (PB) или Tol2 транспозиционной^{системы 24,25,26}. Таким образом, через в утробе матери электропорации, инструментарий ММ и многоцветной “мозаики”, что он генерирует позволяют одновременной маркировки нескольких смежных корковых прародителей и отслеживания их глиального происхождения, в том числе корковых астроцитов, в течение длительных периодов времени. Цветовые контрасты, возникающие в результате выражения четкого FP разрешения разграничения контура PrA и последующего извлечения ключевой информации об их территориальном объеме (с использованием IMARIS) и сложной морфологии (с использованием Vaa3D). Многоцветная стратегия, представленная подробно здесь, является удобным и надежным методом, который дает быстрый и легкий доступ к поверхности корковой астроцитов и морфологии у мышей дикого типа на различных стадиях развития, и легко адаптируется для исследования анатомических особенностей астроцитов в мышиных моделях неврологических заболеваний без использования трансгенных линий репортера.