في Electroporation الرحمية من متعدد الجينوم التكامل اللون (السحر) علامات لفردية استروقراط الماوس القشرية
Summary
أستروقراط بلاط قشرة الدماغ بشكل موحد، مما يجعل تحليل مورفولوجيا معقدة صعبة على المستوى الخلوي. يستخدم البروتوكول المقدم هنا وضع علامات متعددة الألوان استنادًا إلى الإلكتروبورات الرحمية لخَرَد الخلايا الفلكية القشرية وتحليل حجمها ومورفولوجياها باستخدام خط أنابيب لتحليل الصور سهل الاستخدام.
Abstract
تتجاور الخلايا الفلكية بروتوبلازميك (PrA) الموجودة في قشرة الدماغ الماوس بإحكام، مما يشكل مصفوفة ثلاثية الأبعاد مستمرة على ما يبدو في مراحل البالغين. حتى الآن، لا يمكن لأي استراتيجية مناعة أن ينفرد بها وينقطع مورفولوجيا في الحيوانات الناضجة وعلى مدى تكوين الكورتيوجين. ينشأ PrA القشرية من النسل الموجود في اللاميوم الظهري ويمكن استهدافه بسهولة باستخدام في الإلكتروبور الرحمي لناقلات الدمج. يتم تقديم بروتوكول هنا لتسمية هذه الخلايا مع متعدد الجينوم التكامل لون (MAGIC) إستراتيجية علامات، والتي تعتمد على نقل piggyBac /Tol2 وإعادة الدمج Cre /للوكس للتعبير عن stochastically بروتينات الفلورسنت متميزة (الأزرق، السماوي، الأصفر، والأحمر) موجهة إلى مقصورات فرعية محددة. هذه الاستراتيجية رسم خرائط مصير متعددة الألوان تمكن من وضع علامة في الموقع القريبة السلف القشرية مع مجموعات من علامات اللون قبل بدء gliogenesis وتتبع أحفادهم، بما في ذلك الخلايا الفلكية، من مراحل الجنين إلى الكبار على مستوى الخلية الفردية. وضع العلامات شبه المتناثرة التي تحققت عن طريق ضبط تركيز ناقلات الكهربائية وتناقضات اللون المقدمة من متعدد الجينوم التكامل علامات اللون (علامات السحر أو MM) تمكين لفردية الفلكية وتفرد أراضيها والمورفولوجيا المعقدة على الرغم من الترتيب التشريحي الكثيفة. هنا هو سير العمل التجريبي الشامل بما في ذلك تفاصيل إجراء الكهربائي ، ومتعددة القنوات كومة الصور اقتناء عن طريق المجهر confocal ، وتجزئة ثلاثية الأبعاد بمساعدة الكمبيوتر التي من شأنها أن تمكن المجرب لتقييم حجم PRA الفردية ومورفولوجيا. باختصار، electroporation من علامات MAGIC يوفر طريقة مريحة لتسمية كل فرد العديد من الخلايا الفلكية والحصول على الوصول إلى ميزاتها التشريحية في مراحل النمو المختلفة. هذه التقنية ستكون مفيدة لتحليل الخصائص المورفولوجية الفلكية القشرية في نماذج الماوس المختلفة دون اللجوء إلى الصلبان المعقدة مع خطوط مراسل المعدلة وراثيا.
Introduction
تلعب الخلايا الفلكية العديد من الوظائف الحيوية في تنمية الدماغ وعلم وظائف الأعضاء1. بجانب دورهم في حاجز الدم في الدماغ حيث أنها تنظم امتصاص المواد الغذائية وتدفق الدم، وأنها تساهم بنشاط في تشكيل المشبك الوظيفية في حين تنتج neuromodulators التي يمكن أن تغير نشاط وسلوك الخلايا العصبية2. وعلاوة على ذلك، الخلل في علم الدراجات الفلكية يساهم في مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية3. تعرض الخلايا الفلكية الموجودة في قشرة الدماغ مورفولوجيا متقنة تمكن من الاتصال المكثف بالعمليات العصبية. هذه الاتصالات، ضرورية لوظيفة الدائرة، وأيضا السيطرة على morphogenesis الفلكية وsionaptogenesis من خلال البروتينات الخلوية التصاق4. يحتاج علماء الأعصاب إلى أدوات مريحة وقوية للتحقيق في تطور الدراجات الفلكية وmorphogenesis في نماذجهم العصبية ذات الاهتمام. ومع ذلك ، نظرًا لقرب الخلايا الفلكية من جيرانها وتبليطها الثلاثي الأبعاد ، فمن الصعب إفراد الخلايا الفلكية القشرية وتقييم مورفولوجياها بشكل شامل باستخدام المؤشرات المناعية.
حاليا، اثنين من استراتيجيات الهندسة الوراثية الرئيسية تمكين وضع العلامات وفردية من الخلايا الفلكية القشرية في الموقع: تنشيط مراسل متفرق في خطوط الماوس المعدلة وراثيا أو تروس الجانسيس الجسدي باستخدام الكهربائي من plasmids مراسل. الاستراتيجية الأولى تعتمد على تربية خط الماوس مراسل floxed مع الفئران التعبير عن شكل غير قابل للانسج من إعادة الكومبيناز Cre activatinase تنشيطه على وجه التحديد في استربيات عند تسليم تاموكسيفين (على سبيل المثال، Aldh1l1-Creert25). وهناك عدة عيوب ترتبط بهذه الاستراتيجية. أولاً، تتطلب تربية الفئران المعدلة وراثياً عدداً كبيراً من الحيوانات، وعادة ما تكون هناك حاجة إلى عدة مقايسات لتحديد الجرعة المناسبة من تاموكسيفين لتوفير وضع العلامات المتناثرة الكافية للأوعية الفلكية القشرية. تحليل الأنماط الظاهرية الفلكية القشرية في نموذج الماوس الجينية من الفائدة تتطلب أكثر تربية واستهلاك الماوس. وعلاوة على ذلك, في حقن تاموكسيفين الرحمية ومن المعروف أن تتداخل مع الإتحاق, مما يجعل هذه الاستراتيجية من الصعب تطبيقها على دراسة المراحل الأولى من التنمية الفلكية. في الزهية الحمض النووي الكهربائي هو بديل تاموكسيفين خالية استراتيجية تعتمد على الحد الأدنى لعدد الحيوانات6. يتم إجراؤه إما في مراحل الجنين أو ما بعد الولادة ، ويتكون هذا النهج من حقن البلازميدات المراسل في البطينين الجانبي من القوارض تليها البقول الكهربائية التي تخلق المسام في غشاء الخلية ، وبالتالي السماح للحمض النووي لدخول الخلايا السلف بطانة البطين. في وقت لاحق، transgenes مراسل التي تحملها plasmids الكهربائية تتم معالجتها من قبل الآلات الخلية المستهدفة وأعرب عن7. وقد وصفت سابقا اثنين من أساليب الكهربائي لتسمية الماوس القشرية الفلكية: 1) بعد الولادة Astrocyte وضع العلامات عن طريق Electroporation (PALE), الذي يعتمد على الكهربائي من 1-2 واحد لون epismids مراسل epismids في المراحل المبكرة بعد الولادة4; 2) استراتيجية StarTrack على أساس في كهربائي الرحم (IUE) من متعددة لون واحد التكامل مراسل plasmids8،9،10. على الرغم من أن هذه التقنيات اثنين من تسمية بكفاءة PRA في قشرة الدماغ، كما أنها تقدم بعض القيود. في النسخة الأولية، وكلا الطريقتين تعتمد على البروتين حمضية الرجالية الرجالية (GFAP) المروج لدفع التعبير في الخلايا الفلكية، والتي قد تحيز وضع العلامات نحو غليا شعاعي وكذلك البزة وerscycytes التفاعلية التي تعبر عن GFAP بقوة أكثر من العادي يستريح PrA11،12. وفيما يتعلق PALE ، فإن العيوب الأخرى هي المرحلة المتأخرة من الكهربة ، والتي تمنع وضع العلامات على PrA المولودين في وقت مبكر (أو تلك التي تنشأ من أصول delaminating المبكرة) وتحليل المراحل المبكرة من تطوير الأستروجليا ، واستخدام ناقلات episomal التي تصبح مخففة من خلال الانقسامات المتعاقبة خلال الانتشار الهائل الذي يخضع له PrA خلال الأسبوع الأول بعد الولادة13،14. على النقيض من PALE ، يستند StarTrack على الكهربائي الجنيني لـ plasmids المراسل التكاملي الذي يسمح بتتبع مساهمة كل من السلف الجنينية وما بعد الولادة في PrA. مخطط StarTrack المحدثة التي تعتمد على المروج ubiquitin C (UbC-StarTrack) يحقق تعبير أوسع من المراسلين الفلورسنت في كل من النسب العصبي والزلي (شملت الفلكيات) من السلفالعصبية 15،16،17. غير أن تنفيذ هذا النهج في صيغته الحالية معقد، لأنه يعتمد على خليط من خليط من 12 من البلازميدات المتميزة التي تعبر عن ستة بروتينات فلورية مع استثارة جزئية وتداخل أطياف الانبعاثات.
المعروض هنا هو واضح في الرحم الكهربائية القائمة على طريقة وضع العلامات متعددة الألوان باستخدام التكاملية بناءات مراسل مدفوعة من قبل المروج قوية ونشطة على نطاق واسع ل single out astrocytes القشرية14. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير برنامج تحليل الصور سهل باستخدام كل من المرخص (مثل Imaris) والوصول المفتوح (Vaa3D18،19،20)لتحليل الصور لشريحة حجم المناطق الفلكية وarborization ، على التوالي. بالمقارنة مع الأساليب الموصوفة سابقا، تعتمد هذه الاستراتيجية فقط على 1-2 متعددة الألوان المتكاملة transgenes متعددة الجينوم المتكاملة علامات اللون (علامات MAGIC أوMM 21)موجهة إلى cytoplasmic و (اختياريا) مقصور الخلية النووية التي يحركها التعبير من قبل المروج CAG الاصطناعية تتألف من محسن فيروس الخلايا المضخمة للخلايا، الدجاج β-actin المروج، والأرنب β جلوبين لصق موقع متقبل22. وهذا يتيح وضع العلامات وتتبع الخلايا الفلكية القشرية، من مراحل الجنين إلى المراحل المتأخرة بعد الولادة، مستقلة عن التعبير GFAP14،23. ويتحمل كل من هذه FP الأربعة المتميزة التالية: eBFP، mTurquoise2/mCerulean، EYFP، وtdTomato/mCherry، والتي تظهر تداخل طيفي الحد الأدنى الذي يمكن التحايل عليه بسهولة مع 1) اقتناء قناة متسلسلة؛ 2) الأمثل الإثارة السلطة والحصول على جمع؛ و 3) مرشحات dichroic محددة لجمع النوافذ الضيقة FP الانبعاثات. استراتيجية MM يستخدم Cre /lox إعادة الكومبينيشن مع إعادة الكومبينيز (seCre) recombe seCre (seCre) للقيادة التعبير العشوائي من FP في السكان الخلوية. وهناك نسخة واحدة من FP MM تعبر عن FP بطريقة حصرية بعضها البعض، في حين أن عدة transgenes تؤدي إلى تركيبات FP، وخلق العشرات من الأشكال المتميزة. يتم دفع التكامل الجينومي من transgenes من قبل piggyBac (PB) أو نظام نقل Tol224,25,26. لذلك ، من خلال في الإلكتروبورات الرحمية ، فإن مجموعة أدوات MM و “الفسيفساء” المتعددة الألوان التي تولدها تمكن من وضع علامات متزامنة على أصول القشرية القشرية المجاورة المتعددة وتتبع هبوطها الدبقية ، بما في ذلك الخلايا الفلكية القشرية ، على مدى فترات طويلة. تناقضات اللون الناتجة عن التعبير عن FP متميزة تصريح ترسيم من كفاف PrA واستخراج المعلومات الرئيسية في وقت لاحق حول حجم أراضيها (باستخدام IMARIS) ومورفولوجيا معقدة (باستخدام Vaa3D). استراتيجية متعددة الألوان المعروضة بالتفصيل هنا هي طريقة مريحة وقوية تعطي الوصول السريع والسهل إلى سطح الفلكية القشرية ومورفولوجيا في الفئران من النوع البري في مراحل النمو المختلفة ، ويمكن التكيف بسهولة للتحقيق في الميزات التشريحية الفلكية في نماذج الماوس للأمراض العصبية دون استخدام خطوط مراسل المعدلة وراثيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الأقطاب الكهربائية الرحمية (IUE) من علامات MAGIC في السلف القشرية(الشكل 1)تمكين وضع العلامات من الخلايا الفلكية في جميع أنحاء قشرة الدماغ بعد الولادة في مراحل مختلفة بعد الولادة (P4-P7-P21، الشكل 2). ومن المثير للاهتمام، فإن مرحلة IUE ليست حرجة، حيث أن الكهربة التي ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر س. فوكيه ومرافق التصوير والحيوانات الأساسية التابعة لـ Institut de la Vision ومعهد علم الأعصاب دي مونبلييه (MRI وذاكرة الوصول العشوائي) على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل زمالات من Région Ile-de-France و Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer إلى S.C، ومن جامعة باريس – ساكلاي (مبادرات دكتوراليس متعددة التخصصات) إلى لوس أنجلوس، بتمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC-SG 336331، PI J. Valette) إلى E.H.، من قبل الوكالة الوطنية دي لا ريشيرتشي بموجب عقود ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses)، ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2)، ANR-10-INBS-04 (فرنسا BioImaging) ، بواسطة مؤسسة من أجل Médicale Recherche (المرجع DBI20141231328)، من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC-CoG 649117، PI J. Livet) وبرنامج ATIP-Avenir (PI K. Loulier).
Materials
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps – DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors – Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder – 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI – Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
Referencias
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociencias. 103 (4), 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).
- García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
- Martín-López, E., García-Marques, J., Núñez-Llaves, R., López-Mascaraque, L. Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury. PLoS ONE. 8 (9), 74039 (2013).
- Gutiérrez, Y., et al. Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions. Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).
- Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PloS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors. Scientific Reports. 6 (1), 33896 (2016).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., López-Mascaraque, L. Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters. Frontiers in Neuroscience. 9, 87 (2015).
- Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo. Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
- Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).
- Peng, H., et al. Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis. Nature Communications. 5 (1), 4342 (2014).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Abdeladim, L., et al. Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy. Nature Communications. 10 (1), 1662 (2019).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Siddiqi, F., et al. Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
- Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex. Cerebral Cortex. 19, 120-125 (2009).
- Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (65), e4163 (2012).
