由上皮细胞和原发免疫细胞组成的多细胞人类Alveal模型，用于危险评估

瑞士联邦公共卫生局委员会批准了从人体血液中分离出原发性单核细胞的工作（参考编号：611-1，Meldung A110635/2）为阿道夫·默克尔研究所。 1. 将外周血单核细胞（PBMs）与人皮大衣分离 注：以下部分介绍从瑞士伯尔尼的瑞士输血中心购买的一袋50 mL的布衣中免疫细胞的分离。 试剂的制备 每层制备 100 mL 的磁性分离缓冲液：0.5% [w/v] 牛血清白蛋白 （BSA; 在磷酸盐缓冲盐水 [PBS]） 中，用 2 mM 乙酰甲酸 （EDTA）， 并调整为 pH = 7.2，无菌过滤器，孔径为 0.22 μm。在整个过程中保持4°C。 准备细胞培养基 （CCM）： RPMI 1640 与 10% [v/v] 胎儿牛血清 （FBS）， 1% [v/v] L-谷氨酰胺 （这里， 2 mM L-谷氨酰胺）和 1% [v/v] 青霉素链霉素（此处，100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）。注：每个试剂的所需量取决于在以下步骤中要播种的细胞数量。 PPBM 的隔离注：所有玻璃和塑料制品在使用前都需要消毒。出于安全考虑，在处理人体血液样本时，建议使用塑料制品，以减少玻璃器皿受伤的风险。 用剪刀切开装有布衣的袋子的软管端。 通过将袋子内装物直接倒入两个锥形离心机 50 mL 管（每个±25 mL）来分配毛纸涂层。 轻轻倒入或移液器 PBS 放入管中，达到 50 mL 体积。通过将管子轻轻倒置 3 倍来混合内容物。 通过移液 25 mL 在每个新鲜管中的混合物，将毛涂层-PBS 混合物分成四个新的 50 mL 锥形离心管。 使用 10 mL 血清移液器，在布菲涂层-PBS 混合物下方缓慢铺设 13 mL 的密度梯度介质。将填充的移液器从移液器支架上拆下，并立即用拇指插入移液器的上部开口，以防止密度梯度介质的任何额外泄漏到布菲涂层-PBS 混合物中。注：用拇指握住上部开口，将填充移液器放在锥形离心管底部，使密度梯度介质缓慢地流到吹毛糖气涂层-PBS混合物下面，将密度梯度介质留在移液器内约 1 mL。 重复步骤 1.2.5 与其他三个管子包含布衣 -PBS 混合物。 在 1，000 x g 和 25 °C 的慢制动模式下，将含有混合物的所有四管离心 20 分钟。使用带保护盖的支架进行离心。 打开每个管的盖子，使用血清移液器去除含有血浆和血小板的上层，并在生物危害液体废物容器中处理。 使用血清移液器收集外周血单核细胞层，该层在血浆和密度梯度介质层之间显示为白色浊度小段（厚度为±2~3 mm）。颗粒底部含有红血球。避免转移形成最底层的红细胞。对所有四个管重复此。注：外周血单核细胞由PBM和淋巴细胞组成。在磁性 CD14+ 分离期间，PBM 稍后将从淋巴细胞分离。 将外周血单核细胞从四管汇集到两个50 mL管中。 用 PBS 填充两个管，以 50 mL 填充，并盖上盖子。 将原四管中剩余的红细胞和血浆丢弃在生物危害液体废物容器中。 在500 x g 和18~20°C的常规离心机速度下将两个管离心8分钟。 离心后，用血清移液器取出上清液，并丢弃在生物危害液体废物容器中。 使用血清移液器用 5 mL 的 PBS 重新暂停细胞。 将电池悬浮液池入一个 50 mL 锥形离心管中，用 PBS 填充至 50 mL。 使用 5 μL 的细胞悬浮液使用 trypan 蓝色 （45 μL） 排除方法使用细胞计数器计数细胞。 将 trypan Blue-PBM 溶液的移液 10 μL 放入细胞计数器室，并计算每个标准计数协议的细胞数。使用公式 1 计算总单元格数 CT。 计数细胞后，像步骤 1.2.13 中那样将 50 mL 管离心。 CD14 正选 轻轻打开每个管的盖子，然后使用血清移液器取出和丢弃上一液，而不会干扰颗粒。 添加磁分离缓冲液的计算量（公式 2）（此处，每 1 x 107 个总细胞 80 μL 缓冲液），通过上下移液溶液重新悬浮细胞颗粒。 使用方程3（此处，每1 x 107 个总细胞10μL）计算CD14+磁珠的相应体积，并移液器适当的体积。 通过上下移液，合上盖子，在4°C下孵化溶液15分钟， 混合好。 孵育时，用磁性分离缓冲液填充高达50 mL的管。 离心机，如步骤1.2.13中完成。 使用血清移液器吸气并丢弃上流液，而不会干扰细胞颗粒。 移液相应数量的磁分离缓冲液（方程4;这里，每1 x 108 个细胞500μL的缓冲液），通过上下移液3倍轻轻混合。 使用消毒剂喷洒和擦拭磁分离站，对磁分离站进行消毒。将层流罩与用于磁性分离的柱放在一起。 将磁分离柱放在磁场中，将空的 50 mL 锥形离心管直接放在柱下，用于收集洗涤和未标记的电池（即废物）。 通过将 3 mL 的磁分离缓冲液移入磁分离缓冲液冲洗磁分离柱。不要让柱子在整个过程中干涸。 准备 15 mL 锥形离心管和移液器 1 mL 的磁性分离缓冲液。 将电池悬浮液（在步骤 1.3.8 中准备）应用于磁性分离柱。在过滤器下的50 mL锥形离心管中，收集通过的未标记的细胞。注：不要超过每列 2 x10 9 个单元格，以避免阻塞该列。 一旦柱储液罐为空（即，当细胞通过柱时），使用血清移液器应用 3 mL 的磁分离缓冲液，让它穿过柱。重复此 3x。 用手轻轻拉扯，从磁分离器上取下磁分离柱，然后将其放入含有预管1 mL磁分离缓冲液的15 mL管中（在步骤1.3.12中准备）。 向柱中加入 5 mL 的磁性分离缓冲液，通过将柱塞牢固地推入柱体，冲出磁性标记的电池。 MDM 和 MDDC 分化的试剂制备 使用步骤 1.2.17 中完成的 trypan 蓝色排除方法使用单元格计数器计数单元格。 计算所需的 CCM 或 FBS 体积，以执行如下步骤：与 1 x 10 6 个单元/mL（步骤 1.5.1）对应的 CCM 卷，或对应于每 0.9 mL6 6 个细胞密度的 FBS 卷（步骤 1.6.3）。6 合上盖子，将管子放在离心机中，然后像步骤 1.2.13 中那样使用离心机。取出并丢弃上一液，而不干扰细胞颗粒。继续执行步骤 1.5 进行细胞种子设定，步骤 1.6 用于细胞冻结。 PBM 播种和分化为 MM 和 MDDC 按照步骤1.4.2（此处，最终浓度为1 x 106 6 细胞/mL）中计算，通过上下移液3倍，将细胞颗粒重新在计算体积CCM中。 使用血清移液器在单独的锥形离心管中分离成 MM 和 MDDC 的细胞数量移液器。 移液器将系数与 PBM 区分为 CCM，通过上下移液进行良好混合。区分因素应用如下： 对于MDC：最终浓度为10纳克/mL白细胞间素-4（IL-4）和10纳克/mL粒细胞-巨噬细胞-巨噬细胞群刺激因子（GM-CSF）。 对于 MM：最终浓度为 10 ng/mL 巨噬细胞群刺激因子 （M-CSF）。 通过每孔分配3 mL的悬浮液（对应于3 x 106 个细胞/孔，即1 x 106 个细胞/mL），将CCM中的细胞悬浮液与添加的区分因子移入6个孔板中。 将6个孔板放在细胞培养培养箱（37°C，5%CO2）中，让它们区分6天，无需刷新CCM。注：差异化范围从5~8天不等，具体取决于当地可得性的布菲外套和实验装置，前提是使用适当的技术确定差异化效率（请参阅讨论部分）。 Pbm 冻结 将细胞颗粒以9：1（v/v）的比例在低温保护介质中（此处，FBS和二甲基硫化物[DMSO;细胞毒性]）以9：1（v/v）的比例通过调理预警告的FBS体积。这相当于最终细胞浓度为6 x 106 细胞/mL，考虑进一步增加10%DMSO（v/v）。 标记层流罩中所需的低温数量（即记录日期、隔离代码和细胞数量）。 在纯 FBS 中移液 0.9 mL 细胞悬浮液（此处，6 x10 6 细胞在 0.9 mL 的 FBS 中）到每个冷冻。随后，缓慢移液 0.1 mL 的 DMSO 和混合悬浮井，通过上下转动 3 倍的低温。 将冷冻转移到细胞冷冻容器中，并立即将其设置为 -80°C 24 小时。 24小时后，从-80°C冰柜和容器中取出冷冻液，放入适合细胞储存的液氮罐中。 PBM 解冻和分化为 MM 和 MDC 在水浴中将所有必需的试剂加热至37°C（约20~30分钟）。 准备与解冻细胞数对应的 6 个井板的适当数量（此处，每 1.8 x 107 个孔板一个板，即 3 个冷冻板）。在无菌条件下，将 2 mL 的 CCM 移液到每个井中。将板放在培养箱（5 % CO2，37°C）中 15 分钟，使 pH 值平衡。 从液氮罐中用冷冻细胞服用所需数量的冷冻细胞，并在 37 °C 水浴（1~2 分钟）中轻轻旋转，以确保细胞悬浮液均匀解冻。 从水浴中去除低温，用消毒剂去污，确保该剂不会与盖子和 O 环相互作用。注：在此，所有步骤必须在无菌条件下完成。 准备适当数量的 15 mL 锥形离心管，对应于要解冻的冷冻体数量（此处，6 x 106 个 单元/管）。将 9 mL 的预预热 CCM 移入每个管中。 滴管缓慢（滴）冷冻物的内容到含有CCM的管子。合上盖子，重复每个管，以200 x g的离心机 在正常离心机速度下5分钟。 在不干扰颗粒的情况下丢弃上一液。 使用血清移液器（细胞密度对应于 3 x 106 个细胞/mL）上下移液，将每个管中的颗粒（包含来自一个冷冻的细胞）在 2 mL 的预预热 CCM 中重新应发颗粒。 从每个管，移液将重新暂停的细胞分成两个孔（每孔1 mL），包含2 mL先前准备的CCM，以达到3×106 细胞/孔的细胞密度（对应于1 x 106 6 细胞/mL的最终浓度）。对所有其他管重复此重复。 继续区分，如第 1.5.3 节所述。 将6个孔板放在细胞培养培养箱（37°C，5%CO2）中，让它们区分6天，无需刷新CCM。 2. 人类肺活骨上皮组织的三重细胞共培养模型 注：本节提供与12个井板插入物对应的体积和电池号的说明。图 1 总结了模型程序集的建议时间线。 上皮细胞（A549细胞系）播种 根据供应商 （ATTC） 提供的建议培养上皮细胞。简言之，在80%的细胞汇合下（大约每周2x~3倍）对CCM中的细胞进行亚培养。注：亚培养 A549 用于共培养模型组合之前至少四个段落，使用 A549 细胞在 5~25 的通道范围内。 将预预热 CCM 移入 12 个井板（井数对应于所需型号数）的管道 1.5 mL。 使用灭菌钳将单个 12 孔细胞培养物插入 12 孔板的孔中。 根据子培养协议从烧瓶中分离细胞（即，使用分离剂，像步骤 1.2.13 中那样通过离心去除该剂）。在适当的CCM体积中重新悬浮，对应于A549的最终细胞浓度（此处，50 x 104 细胞/mL;每个插入的0.5 mL细胞悬浮液，即25 x 104个 细胞/插入，对应于27.8 x 104细胞 /厘米2的播种密度。 使用 1 mL 移液器将 0.5 mL 的细胞悬浮液（即 25 x10 4 个 单元/插入）移液器插入插入的边。 用盖子盖住盘子，并把它们放在细胞培养箱（37°C，5 % CO2）中4天。注：定期检查相位对比显微镜下 A549 细胞的汇合。 MDDC 种子 在含有MDC的6个井板中用未连接的细胞吸附CCM。 在每个井中加入1 mL 的新鲜预预热 CCM。 使用电池刮刀，从每口井分离（刮）粘附MDDC，用现有的1 mL的CCM 3x轻轻清洗油井，并将它们组合成一个锥形离心管。 使用 trypan 蓝色排除方法使用 10 μL 的细胞悬浮液和 10 μL 的 trypan 蓝色溶液使用单元格计数器计数细胞。 像步骤 1.2.13 中那样将电池悬浮液离心。 计算重新计算所需的 CCM 体积（公式 5）：<!– –> 所需的MDDC密度 = 42 x 104 个细胞/mL;每个插入需要 6.3 x 104 个单元，对应于种子细胞密度 7 x 104 细胞/cm2（ 此处，在步骤 2.2.10 中添加到 0.9 cm2 上 150 μL）。用于细胞再彭的 CCM 体积 （Vm;等式5）： 轻轻吸气，从 12 个孔板的上腔中吸气并丢弃 CCM，刀片上不断生长 A549。 使用消毒的钳子将带 A549 细胞的刀片倒置放在无菌培养皿中。使用 PBS 准备锥形离心管 （50 mL），并预滋润细胞刮刀。 从刀片的基面（即倒置位置的上部）刮掉 A549 细胞，这些单元应通过刀片的毛孔生长。注：在刮取单个样品之间用 PBS（用管子中准备）冲洗刮刀，并在整个过程中保持湿润。 离心（步骤2.2.5）后，吸气并丢弃上流水器，然后重新增发计算量CCM（步骤2.2.6）和移液器上下3倍的MDDC颗粒。 每个刀片顶部的单元悬浮液 150 μL，使刀片的整个基底表面均被液体覆盖，且不含气泡。 用盖子盖住盘子，放在细胞培养箱中70分钟。从细胞培养板中吸出CCM（最初放置的插件），将其丢弃在生物危害液体废物中，并移液器1.5 mL的新鲜CCM进入每个孔中。用盖子盖住盘子，放在细胞培养箱中（37°C，5% CO2）。注：不要超过上述时间段，以免使细胞干燥。 孵育后，小心地用消毒钳子握住每个刀片，并将其放在包含CCM的板子中，放在一个普通的位置。用盖子盖住盘子，然后返回细胞培养箱（37°C，5% CO2）。 巨噬细胞 （MDM） 播种 拿 6 个包含预分化的 MM 的井板， 把它们从细胞培养箱放在层流罩上。 吸气和丢弃CCM与未连接的MM生长在6个井板，和移液器1 mL的新鲜预预热CCM在每个井。 使用细胞刮刀，轻轻地从单个孔中去除粘附的 MM（如 MDDC 的步骤 2.2.3 所示）。 将 10 μL 的锥板蓝色移入井或管中，并加入 10 μL 的 MDM 悬浮液，以实现 1：1 （v/v） 的最终稀释。使用适当的计数协议计算 MM 的数量。 像步骤 1.2.13 中那样将电池悬浮液离心。 计算所需的体积（公式 6）：在 CCM 中所需的 MDM 密度 = 2.5 x10 4 4 细胞/mL（此处，每个插入在 0.5 mL CCM 中需要 1.25 x 104 个细胞，这相当于种子细胞密度 1.4 x10 4 细胞 /cm2）。(6) 离心后，吸气并丢弃上流水，在计算量CCM（步骤2.3.6）中重增MDM颗粒，并上下移液器3倍。 使用 1 mL 移液器小心移液器 0.5 mL MDM 悬浮液（在步骤 2.3.7 中准备）在细胞培养单元壁上使用 A549 和 MDDC（不直接在上皮细胞上）。盖上带盖子的盖子，放在细胞培养培养箱（37°C，5 % CO2）中，24小时。 将共培养模型转移到空液接口 （ALI） 在细胞培养培养箱中组装模型的24小时（±2小时）孵化期结束时，从细胞培养物插入物的脂肪和基础部分和井中吸气并丢弃CCM。 使用灭菌钳子，使用 1 mL 移液器将单个刀片从井中提起，并移液器 0.6 mL 的新鲜预预热 CCM 到每个孔。请勿将 CCM 添加到插入的边。 盖上带盖子的盖板，并放在细胞培养培养箱（37°C，5 % CO2）中，24小时前进一步使用。 3. 接触选定的阳性对控（诱导刺激性反应的已知刺激） 注：将共培养模型暴露在已知前炎刺激内毒素脂质糖 （LPS）7 和蛋白炎细胞因子肿瘤坏死因子 +（TNF-+）7 中，用于说明模型的响应能力。此外，接触洗涤剂（Triton X-100）用于确认乳酸脱氢酶（LDH）测定的敏感性。 准备正控制解决方案：LPS 库存（蒸馏水中 1 mg/mL）、TNF-α 库存（蒸馏水中 100 μg/mL）和 Triton-X 100（PBS 中 2% [v/v]）。 在ALI条件下的共培养模型的24小时孵育时，从基底隔间中吸气并丢弃上经剂。使用灭菌钳子，从井中提起单独的刀片，将 0.6 mL 的新鲜预预热 CCM 提升到每个孔中。 通过稀释锥形离心管中的 CCM 库存，准备单独的正对控工作解决方案，如下所示：1 μg/mL LPS、1 μg/mL TNF-Ω 和 0.2% Triton-X 100。卷对应于测试插入数（此处为 100 μL/插入）。通过上下移液 3 倍，将解决方案混合好。 通过缓慢移液施加细胞培养插入的壁面，应用每个正对控制溶液的 100 μL。用盖子盖住井板，并放在细胞培养箱（37°C，5%CO2）中24小时。孵育时，使用钳子固定单独的刀片，吸气并丢弃刀片的面。 在基底隔间中收集CCM，储存在1）4°C，用于进一步LDH分析，表示细胞膜破裂介质的细胞毒性，和/或2）储存在-80°C，通过酶链接免疫吸附剂测定（ELISA）进一步分析蛋白质释放。根据套件供应商的建议运行检测。 去除CCM后，用PBS 3x清洗刀片，并将细胞培养中细胞培养物上细胞固定为4%（w/v）半成甲醛（在PBS中，室温下为15分钟），确保两个刀片两侧均用PFA溶液覆盖。随后用 PBS 洗涤 3x 以去除 PFA。将浸入PBS中的样品存放在4°C，以进行进一步的免疫污染（该方法的一个示例在17之前已经描述过）。