Ein planarischer Motilitätstest zur Messung der biomodulierenden Eigenschaften natürlicher Produkte
Summary
Planare Beweglichkeit wird verwendet, um die Stimulans und Entzugseigenschaften von naturwissenschaftlichen Produkten im Vergleich zur Bewegung der Tiere im Quellwasser allein zu messen.
Abstract
Beschrieben wird ein einfaches, kontrollierbares Mittel zur Verwendung des nicht-parasitären Planariers Dugesia tigrina, eines freilebenden Aqua-Flachwurms, um die Stimulans- und Entzugseigenschaften natürlicher Produkte zu untersuchen. Experimentelle Assays, die von einzigartigen Aspekten der planarischen Physiologie profitieren, wurden auf Studien zur Wundheilung, Regeneration und Tumorgenese angewendet. Da Planarier eine Sensibilität für eine Vielzahl von Umweltreizen aufweisen und in der Lage sind, konditionierte Reaktionen zu lernen und zu entwickeln, können sie in Verhaltensstudien verwendet werden, die Lernen und Gedächtnis untersuchen. Planarier besitzen eine grundlegende bilaterale Symmetrie und ein zentrales Nervensystem, das Neurotransmitter-Systeme verwendet, die für Studien zur Untersuchung der Auswirkungen neuromuskulärer Biomodulatoren geeignet sind. Folglich wurden experimentelle Systeme zur Überwachung der planaren Bewegung und Beweglichkeit entwickelt, um Die Sucht und Denentzug von Substanzen zu untersuchen. Da die planare Beweglichkeit das Potenzial für ein empfindliches, leicht standardisiertes Motilitäts-Assay-System zur Überwachung der Wirkung von Reizen bietet, wurde der planarische Bewegungsgeschwindigkeitstest (pLmV) angepasst, um sowohl das Stimulations- als auch das Entzugsverhalten von Planariern durch die Bestimmung der Anzahl der von den Tieren mit der Zeit gekreuzten Gitterlinien zu überwachen. Hier werden die Technik und ihre Anwendung demonstriert und erklärt.
Introduction
Das beschriebene Protokoll verwendet die planare Beweglichkeit, um die biomodulierende Wirkung natürlicher Substanzen zu bewerten. Es wurde speziell angepasst, um festzustellen, ob diese Substanzen als Stimulanzien funktionieren, und ob sie dann mit einem messbaren Entzugsverhalten in Verbindung gebracht wurden1. Dieser Assay, bekannt als planarianer Lokomotorvelocity (pLmV) Test, wurde zuerst verwendet, um bekannte pharmakologische Wirkstoffe zu testen2,3. Die Anwendung dieses planarrischen Motilitäts-basierten Assays hat seitdem an Popularität gewonnen und wurde von verschiedenen Laboratorien angenommen, die an anderen Stoffen als natürlichenProdukten4,5interessiert sind. Für diesen Test wird ein Planarier in eine Petrischale mit Quellwasser oder Quellwasser mit gelöstem Biomodulator gelegt. Da die Schale selbst auf Graphenpapier platziert wird, kann die Anzahl der Gitterlinien, die das Tier mit der Zeit überquert, während es sich um den Behälter bewegt, verwendet werden, um die Bewegungsgeschwindigkeit in jedem Zustand zu bestimmen. Der Hell-Dunkel-Test, auch als Konditionierter Ortspräferenztest (CPP) bezeichnet, ist eine weitere Variante des Themas der Überwachung der planaren Beweglichkeit und bewertet, wie schnell die Tiere reagieren und in eine abgedunkelte Umgebung wandern6,7. Video-Tracking von planaren Bewegungen kann auch mit Computerprogrammen und Massenzentrum (COM) Tracking8,9,10,11analysiert werden.
Die Verwendung des Planariers als Tiermodell für solche Studien bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Tieren, da der Experimentator die Assay-Umgebung leicht kontrollieren kann. Insbesondere kann das Aushungern der Planarier vor dem Experimentieren ihre Exposition gegenüber anderen Ernährungs- oder pharmakologischen Wirkstoffen verhindern, die die Ergebnisse sonst verwirren könnten, und der spezifische Biomodulator, der untersucht wird, kann einfach durch direkte Zugabe in das Kulturwasser in die Planarier eingeführt werden, wodurch die Exposition standardisiert wird. Da Planarier ein Nervensystem und Neurotransmitter haben, die an Tiere höherer Ordnung erinnern, gelten die Physiologie und die experimentellen Reaktionen dieser Tiere auf neuromuskuläre Reize als biologisch relevant für andere Organismen12,13,14,15,16. Auch weil Planarier relativ kostengünstig und unkompliziert im Labor zu warten sind, bieten sie vielen Forschern ein zugängliches biologisches Modell.
Als Versuchstier eignen sich Planarier für eine Vielzahl von Studien. Zum Beispiel, unsere Gruppe, sowie andere Forscher verwenden Planarier Tumorigenese17,18,19zu studieren. Planarier zeigen auch eine Vielzahl von Reaktionsverhalten auf chemische, thermische, gravitarische, elektrische, Foto- und magnetische Reize, die die Grundlage anderer Assay-Systeme bildeten. Einige dieser Effekte wurden verwendet, um lernen und Gedächtnis bei diesen Tieren zu studieren20,21,22,23,24,25,26,27. Die primäre Verwendung des planarischen Modells in der Literatur konzentriert sich derzeit auf die Aktivität von planarianischen pluripotenten Stammzellen, neoblasten genannt, und ihre Rolle bei der Regeneration28,29,30. Die Annahme des hier beschriebenen Modells ermöglicht daher weitere Studien mit anderen planarianbasierten Assays, um ein breiteres Verständnis dafür zu vermitteln, wie natürliche Produkte und andere Biomodulatoren den Organismus beeinflussen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein einfacher und zugänglicher planarer Motilitätstest wird beschrieben, um die Stimulans- und Entzugserscheinungen natürlicher Produkte zu bestimmen. Als Verhaltensmodell ist es notwendig, strenge Protokolle für scoring Bewegung und klare Definitionen von Verhaltensweisen zu haben, um Beobachtungen zwischen verschiedenen Experimentatoren zu standardisieren. Die vorgestellten Ideen zeigen, wie dies erreicht werden kann. Jedes Labor, das dieses Protokoll verwendet, sollte die vorgelegten Informationen an die Auswirkun…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten das Büro von Institutional Advancement und die Morrisville College Foundation für ein Publikationsstipendium zur Unterstützung dieser Arbeit sowie das SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) für ihre laufende Unterstützung und Unterstützung der Bachelor-Forschung bei SUNY Morrisville würdigen. Wir möchten auch Sophia Hutchens für die hilfreichen Kommentare zu der beschriebenen Technik danken.
Materials
| Bottled Water – 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish – 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish – 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap – 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container – 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) – soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
Referencias
- Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
- Raffa, R. B., Valdez, J. M. Cocaine withdrawal in Planaria. European Journal of Pharmacology. 430 (1), 143-145 (2001).
- Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
- Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
- Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
- Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. , 8-13 (2013).
- Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
- Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
- Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
- Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
- Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
- Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
- Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
- Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neurociencias. 153 (4), 1103-1114 (2008).
- Raffa, R. B., Rawls, S. M. . A model for drug action and abuse. , (2008).
- Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
- Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
- Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
- Mason, P. R. Chemo-klino-kinesis in planarian food location. Animal Behaviour. 23 (2), 460-469 (1975).
- Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
- Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
- Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
- de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
- Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
- Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
- Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
- Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
- Itoh, M. T., Igarashi, J. Circadian rhythm of serotonin levels in planarians. Neuroreports. 11 (3), 473-476 (2000).
- Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
- Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
- Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
- Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
- Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
- Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
- Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
- Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
- Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
- Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a ‘bath salt’ cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
- Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).
