Vi præsenterer en in vitro vaskulær sygdom model til at undersøge fuldblods interaktioner med patient-afledt endotel. Dette system gør det muligt at studere trombogen egenskaber af primære endotelceller under forskellige omstændigheder. Metoden er specielt velegnet til at evaluere in situ trombogenicity og antikoagulationsbehandling under forskellige faser af koagulation.
Dannelsen af blodpropper indebærer komplekse interaktioner mellem endotelceller, deres underliggende matrix, forskellige blodlegemer, og proteiner. Endotelet er den primære kilde til mange af de store hæmostatiske molekyler, der styrer blodpladesammenlægning, koagulation og fibrinolyse. Selv om mekanismen for trombose er blevet undersøgt i årtier, in vitro undersøgelser primært fokusere på situationer med vaskulære skader, hvor subendotel matrix bliver udsat, eller på interaktioner mellem celler med enkelt blodkomponenter. Vores metode gør det muligt at studere interaktioner mellem fuldblod og en intakt, sammenløbet vaskulære celle netværk.
Ved at udnytte primære humane endotelceller, denne protokol giver en enestående mulighed for at studere indflydelsen af endotelceller på trombe dynamik og giver værdifuld indsigt i patofysiologi af trombotisk sygdom. Brugen af skræddersyede mikrofluidiske flowkanaler gør det muligt at anvende sygdomsspecifikke vaskulære geometrier og modelspecifikke morfologiske vaskulære ændringer. Udviklingen af en trombe registreres i realtid og kvantitativt karakteriseret ved trombocyt vedhæftning og fibrin deposition. Effekten af endotelfunktionen i ændret trombedynamik bestemmes ved postanalyse gennem immunfluorescensfarvning af specifikke molekyler.
De repræsentative resultater beskriver den eksperimentelle opsætning, dataindsamling og dataanalyse. Afhængigt af forskningsspørgsmål, parametre for hver sektion kan justeres, herunder celletype, forskydning satser, kanal geometri, medicinsk behandling, og postanalyse procedurer. Protokollen valideres ved at kvantificere trombedannelse på lungearterien endotel af patienter med kronisk tromboembolisk sygdom.
Endotel danner det indre cellulære lag af blodkar og adskiller blod fra det omgivende væv. Det er blevet beskrevet som et dynamisk organ, der aktivt regulerer sin mikro-miljø og reagerer på eksterne stimuli1. På grund af sin direkte kontakt med strømmende blod, endotel er afgørende i kontrollen af hæmostase og trombose og er den primære kilde til mange af de store regulerende molekyler, der styrer blodplade sammenlægning, koagulation, og fibrinolyse2. Sunde, ikke-aktive endotelceller (EF) producerer flere molekyler, der modvirker kopladeaktivering og forhindrer koagulation og trombedannelse for at opretholde blodgennemstrømningen, såsom prostacyclin, trombomodulin eller vævsfaktorvejshæmmer (TFPI)2,3. Dette forhindrer vedhæftning af blodplader, blodpladesammenlægning, og trombe dannelse. Beskadigelse eller aktivering af karvæggen resulterer i en prokoagulerende endotelfænotype, der initierer lokaliseret trombocyt vedhæftning ogblodpropformation 2,4. Ved endotelaktivering klæber blodplader til von Willebrand Factor (VWF), et multimerisk protein, der frigives fra EC’er, eller til udsatte bindingssteder i den underliggende subendotelmatrix. Efterfølgende initieres molekylære ændringer i blodplader og eksponering for vævsfaktor (TF) aktiveringen af koagulationssystemet, hvilket fremkalder trombedannelse ved fibrinpolymerisering5,6. Tilsammen danner den resulterende blodprop grundlag for sårlukning ved re-endoalisering7. Forstyrrelser af koagulationssystemet kan resultere i blødningsforstyrrelser, såsom von Willebrand sygdom, hæmofili, eller trombose, der ofte skyldes en dysregulated pro- og antithrombotisk balance af endotel hæmostatisk vej2,3.
Processen med hæmostase forekommer i både arteriel og venøs cirkulation. Men de mekanismer, der ligger til grund for arteriel og venøs trombose er fundamentalt forskellige. Mens arteriel trombose, som det ses i iskæmisk hjertesygdom, er for det meste drevet af brud på en aterosklerotisk plaque under forhold med høj forskydning stress, venøs trombose meste udvikler sig i mangel af endotel skade i en tilstand af stasis8,9,10. En dyb vene trombe kan embolisere og rejse mod lungearterier, hvor det forårsager en lungeemboli. Dette kan resultere i kroniske vaskulære forhindringer, der fører til signifikant nedsat funktionel kapacitet, der kan fremme udviklingen af chonic lungesygdomme, herunder udvikling af kronisk tromboembolisk pulmonal hypertension (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH er karakteriseret ved forhøjet lungetryk på grund af obstruktioner af lungearterierne ved tromboembolisk materiale efter mindst tre måneders antikoagulationsbehandling15. Ud over lunge emboli, Er det postuleret, at lungeendotel giver en prothrombotic miljø i CTEPH, der letter in situ trombose og kroniske forhindringer af lungearterierne, forårsager stigningen i blodtrykket, der i sidste ende kan resultere i hjertesvigt, hvis ubehandlet16,17.
I løbet af de seneste år har forskellige undersøgelser ført til udvikling af analyser for at undersøge trombedannelse ved at måle blodpladefunktion og koagulation18. Men de fleste af dem enten studere samspillet mellem fuldblod med enkelt ekstracellulære matrix komponenter som kollagner eller fibriner, eller endotelfunktion i samspil med enkelt blodkomponenter, såsom endotel-blodplader eller endotel-leukocyt interaktion19,20,21,22. Disse analyser er mest almindeligt udført med menneskelige navlestrengsceller endotelceller (HUVEC), da disse celler er let opnås. Men, hæmostatiske gener er differentieret udtrykt på tværs af vaskulære træ, fartøjstyper, og organsystemer23,24, som gør brugen af HUVECs til at repræsentere endotelceller involveret i arteriel trombose eller lungeemboli problematisk23.
Ud over EF-plastitet kan sygdomsspecifikke hæmodynamiske ændringer og ændringer i vaskulær morfologi fremme trombedannelse ved den normale endotel25. Højere forskydningshastigheder, på grund af lokal vasokonstriktion eller ændringer i kargeometri, for eksempel, kan resultere i akut trombedannelse, hvilket forårsager en stenose, der fremskynder ophør af blodgennemstrømningen26. Brugen af skræddersyede mikroengineered flow kanaler gør det muligt specifikt at designe vaskulære geometrier, der er repræsentative for (pato)biologi. På denne måde er det muligt at undersøge virkningen af lokale biomekaniske kræfter på sunde eller syge EF27.
Der er antikoagulation behandlinger til rådighed for målretning forskellige faser og molekyler i koagulation kaskade, som alle udgør særlige risici og fordele, der kan være specifikke for visse lidelser. Tilgangen af sygdom modellering beskrevet i dette papir er specielt velegnet til at teste virkningerne af forskellige antikoagulation og antiplatelet behandlinger på trombe dynamik.
Målet er at præsentere en model af trombose, der omfatter primære EC’er, hvilket giver en alsidig model egnet til analyse af forskellige former for trombose afhængigt af typen af primære EC anvendes. Som illustration brugte vi lungepulsåre endotelceller fra CTEPH-patienter i samspil med fuldblod, der indeholdt alle komponenter, der var involveret i trombedannelse (blodplader, leukocytter, erythrocytter, koagulationsproteiner og cofaktorer). Denne fremgangsmåde kan anvendes i kommercielle parallelle flowkanaler eller i skræddersyede mikrofluidiske flowkanaler med et specifikt vaskulært design. Som sådan, modellen kan i sidste ende anvendes i studiet af trombe dannelse og opløsning, til vurdering af inflammatoriske reaktioner i sygdom modellering, for antiplatelet eller antikoagulation terapi, og i sidste ende for personlig medicin.
Denne undersøgelse beskriver isolering af primære humane lungepulsåren endotelceller. Til isolering af andre primære humane endotelcelletyper henviser vi til tidligere offentliggjorte metoder, herunder lungemikrovaskulære endotelceller25, humane navlestrengens endotelceller28og blodcirkulationende endotelkoloni, der danner celler Figur 1A29.
Koagulation er et resultat af det komplekse og tidsmæssigt kontrollerede samspil mellem endotel og blodkomponenter. Denne in vitro assay præsenterer en metode til at undersøge trombogen egenskaber endotelceller i realtid. Forskellige typer af primære humane endotelceller kan anvendes, lette in situ trombose i et organ og patient-specifik måde. I denne undersøgelse illustrerede vi brugen af denne protokol, der sammenlignede trombogeniske egenskaber af PAECs isoleret fra raske donorer versus CTEPH patienter. Levende trombedannelse blev undersøgt ved perfusion af fuldblod fra raske forsøgspersoner over histaminaktiveret endotel, mens effekten af en DOAC blev testet som et antithrombotisk middel.
Ud over brugen af kommercielt tilgængelige mikrokanaler, som vist i de repræsentative resultater, muliggør indførelsen af de skræddersyede mikrofluidiske kanaler studiet af vaskulære geometriændringers indflydelse på trombedannelsen. F.eks. resulterer flowreduktioner ved et grenpunkt eller stenose i en stigning i forskydningsstress og mere blodpladeaktivering36. En betydelig begrænsning af disse specialfremstillede mikrofluidiske kanaler er imidlertid kravet om høje celletal for at danne et stabilt monolag af EC’er som beskrevet i trin 2.3.2. Dette kan udgøre en begrænsende faktor, når patient-afledte celler er knappe. Styrkerne ved de kommercielt tilgængelige mikroskredse er, at overfladearealer ændres til cellekultur, og vækstområderne er større, hvilket gør det muligt for EC’er at danne et sammenløb og et stabilt monolag. På den anden side vil et større overfladeareal resultere i en større lumen. Ifølge Equation 1, dette kræver højere blodmængder at nå lignende strømningshastigheder som i de skræddersyede microfluidics.
En forbedring af denne protokol kunne være at undersøge levende EF tab eller ændringer i barriere integritet. EF-skader i denne protokol måles kun ved forsøgets afslutning. Til live-sporing kan ECs mærkes med mCherry VE-cadherin,f.eks. Da dette imidlertid ville kræve en stærkt optimeret protokol med effektiv virus transfection, Electric Cell-substrat Impedance Sensing (ECIS) kunne bruges som et alternativ til at studere endotel integritet og barriere funktion38. Perfusion over særlige ECIS-flowkanaler muliggør overvågning i længderetningen af endotelbarriereintegritet under flow. Disse specifikke ECIS-funktioner giver mulighed for parallelle målinger af endotelbarriereegenskaber og trombedannelse. Alternative måder til parallelle EF-barrieremålinger, især i de skræddersyede arrays, omfatter brugen af fluorescerende dextrans i perfusatet, som spredes ud af lumen, afhængigt af EF-barriereegenskaberne.
En begrænsning af den beskrevne protokol er, at ECs fjernes fra den menneskelige krop og dyrkes på vævskultur plast, som er en stiv, kunstig substrat. Celler tilpasser sig deres biofysiske miljø. Dette kan muligvis påvirke endotelrespons på blodpladeaktivering, da der er en sammenhæng mellem trombocytaktivering og vægstivhed39. På trods af disse tilpasninger til dyrkningsplast har celler sygdomsspecifikke egenskaber, der kan identificeres i direkte sammenligning med EC’er, der stammer fra raske donorer, som vist med kontrol, CTEPH-PAEC og HUVEC, der udøvede forskellige trombocytvedhæftningsmønstre og fibrinaflejring efter 5 min blodperfusion.
I modsætning til andre protokoller bruger dette system fuldblod, mens andre studerer EF-interaktion med en enkelt blodkomponent såsom blodplader og leukocytter19,20,21. Der har været mere avancerede mikrofluidiske modeller udviklet, der gør det muligt at studere endotelfunktion i en vaskulær model med en rund beholdergeometri og blød ekstracellulær matrix. Disse er dog optimeret med HUVECs40,41,42. Det nye ved den beskrevne protokol er brugen af primære EC’er kombineret med fuldblod, der bringer modelleringen af in situ trombose et skridt tættere på in vivo betingelser. Efter at have optimeret protokollen for brug af patient-afledte ECs og patient-afledt blod yderligere optimerer sygdom modellering in vitro, så vurderingen af personlig trombe dannelse og narkotikabehandling.
Den beskrevne protokol kan anvendes til at undersøge effekten af antikoagulationsterapier på patientafledte celler. Mens vi brugte dabigatran til at hæmme trombedannelse, er det muligt at bruge andre antikoagulanter, såsom rivaroxaban, som direkte hæmmer faktor Xa i koagulationkaskade. Direkte blodpladehæmmere som clopidogrel eller aspirin kan undersøges så godt, da disse virker på den primære fase af hæmostase, hvor blodplader binder sig til ECs. I sidste ende kan den trombogeniske kapacitet af patientspecifikke EC’er i samspil med patientens eget blod bruges til at forudsige den personlige virkning af antikoagulationsbehandling på den enkelte patient. Desuden kan en knockdown af specifikke proteiner give yderligere funktionelle oplysninger.
Der er nogle trin i den beskrevne protokol, der er afgørende for et vellykket perfusion-eksperiment. For det første er det under isoleringen af primærceller nødvendigt at opnå en meget ren EF-kultur. For det andet er det vigtigt, at EC danner et stabilt sammenflydende monolag. Hvis dette ikke er tilfældet, kan en lille ændring i forskydningsstress forårsage endotelskader og aktivering af koagulationskskaden, eller blodplader kan begynde at binde sig til kældermembranen, hvilket vil give falske positive resultater. For det tredje er det vigtigt at forhindre luftbobler, da de kan beskadige endotelet og dermed påvirke resultaterne.
Efter genberegning af citrerede blod med calciumchlorid og magnesiumchlorid, er det vigtigt straks at starte perfusion eksperimentet. Genberegningen fremkalder en hurtig reaktion i trombocytaktivering og trombedannelse, hvilket resulterer i hurtig koagulation i prøven.
Afslutningsvis beskriver vi en meget alsidig protokol til at studere fuldblods-endotelcelle interaktioner under trombose.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jan Voorberg fra Institut for Plasma Proteiner, Sanquin Research og Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Holland, for hans input i dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af den hollandske CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] tildelt Phaedra og Reconnect-konsortiet samt Impulstilskuddet 2018 tildelt Phaedra IMPACT-konsortiet. Disse tilskud omfatter kollektiv finansiering fra Dutch Heart Foundation, Dutch Federation of University Medical Centers, The Netherlands Organization for Health Research and Development og Royal Netherlands Academy of Sciences. Desuden blev dette arbejde finansieret af Det Europæiske Forskningsråd under programmet »VeSCEL« (tilskudsnummer: 669768). XDM er finansieret af et forskningstilskud fra Institut for CardioVascular Research (ICaR-VU) på VU University Medical Center, Amsterdam, Holland.
20 mL syringe | BD Plastipak | 300613 | |
20X objective | Olympus | ||
2-Propanol (IPA) | Boom | 76051455 . 5000 | |
Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
Alexa647 Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 0.180555556 |
Biopsy punch 1 mm diameter, Integra Miltex | Ted Pella | 15110-10 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A9647 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
Citric Acid | Merck | 244 | |
Collagen Typ I | Corning | 354249 | 0,1 mg/mL |
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
Cross-flow hood | Basan | ||
Desiccator | Duran | 24 782 69 | |
D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F0895 | |
Flow tubings | ibidi | 10831, 10841 | |
Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
ibidi µ-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
ImageJ | ImageJ | v1.49 | |
KCl | Merck | 7447-40-7 | |
Lab oven | Quincy | 10GC | |
LS720 Fluorescent microscope | etaluma | LS720 | |
Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, and Female tube connectors |
MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | |
Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
sodium citrate blood collection tubes | BD Vacutainer | 363048 | |
trisodium citrate | Merck | 6448 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |