Configuration de la spectrométrie de masse plasmatique capillaire couplée à l’électrophorèse (CE-ICP-MS) pour la quantification des espèces de redox de fer (Fe(II), Fe(III))

ATTENTION : La méthode utilise de l’acide chlorhydrique (HCl, dilutions de départ de l’ultrapure, concentration 1 M) et du tétraméthylammoniumhydroxyde (TMAH, dilutions de départ de l’ultrapure, concentration 25%). Les deux substances sont fortement corrosives. Utilisez la protection de la peau et des yeux. 1. Préparation d’électrolytes Préparation des électrolytes HCl : électrolyte de fond (20 mM HCl), électrolyte de sortie (5 mM HCl) et électrolyte de terminaison (0,05 mM HCl) Préparer 20 mM HCl dans une fiole de 100 mL : Pipette 2 ml de 1 M HCl dans la fiole, remplir jusqu’à la marque avec de l’eau ultrapure et secouer doucement. Préparer 5 mM HCl dans une fiole de 100 mL : Pipette 500 μL de 1 M HCl dans la fiole, remplir jusqu’à la marque avec de l’eau ultrapure et secouer doucement. Préparer 0,05 mM HCl en deux étapes: Pipette 1 mL de 20 mM HCl dans une fiole de 100 mL, puis remplir jusqu’à la marque avec de l’eau ultrapure et secouer doucement. Par la suite, la pipette 2,5 ml de cette dernière solution dans un tube conique de 15 mL(Table des Matériaux)et ajouter 7,5 ml d’eau ultrapure, puis secouer doucement. Préparation d’électrolytes de premier plan 12% TMAH dans un tube conique de 15 mL : Pipette 4,8 mL de 25% de TMAH dans le tube, ajouter 5,2 ml d’eau ultrapure et secouer doucement.REMARQUE : Le TMAH à 12 % est utilisé pour purger et nettoyer le capillaire avant chaque course et comme électrolyte de premier plan devant l’échantillon injecté). 2. Préparation et stockage des normes et des échantillons Normes Pour Fe(II), peser 35,61 mg de Fe(II)Cl2·4H2O dans une fiole de 100 ml et remplir jusqu’à la marque de 100 ml avec de l’eau ultrapure pour une concentration de 100 mg fe(II)/L. Agiter doucement jusqu’à la dissolution complète. Pour Fe(III), peser 29,04 mg de Fe(III)Cl3 dans une fiole de 100 mL et remplir jusqu’à la marque de 100 ml avec de l’eau ultrapure pour une concentration de 100 mg fe(III)/L. Agiter doucement jusqu’à la dissolution complète. Diluer chaque solution standard selon le tableau 1 pour préparer les solutions standard de travail.REMARQUE : Après avoir préparé les solutions quotidiennes de stock à partir de la solution de stock de 100 mg/L, ces dernières doivent être conservées congelées. Après avoir préparé les normes quotidiennes conformément au tableau 1, la solution de stock de 1 mg/L doit être aliquée en volumes de 1,5 mL et stockée congelée (meilleure sans air laissé sur le dessus) dans des tubes de 1,5 mL. Pour chaque nouveau jour, un plafond quotidien de stock est décongelé pour la préparation des normes quotidiennes et retiré après utilisation. Concentration de départ Volume de pipetage Remplissez-le d’eau Milli-Q Concentration résultante Volume final Utilisation de la solution 100 mg/L 50 μL 4950 μL 1 mg/L 50 mL Solution quotidienne de stock 1 mg/L 200 μL 1800 μL 100 μg/L 2 mL Standard 100 μg/L 1 mg/L 100 μL 1900 μL 50 μg/L 2 mL Standard 50 μg/L 1 mg/L 50 μL 1950 μL 25 μg/L 2 mL Standard 25 μg/L 1 mg/L 25 μL 1975μL 12,5μg/L 2 mL Standard 12,5 μg/l 1 mg/L 20 μL 1980μL 10 μg/L 2 mL Standard 10 μg/L 0 2000 μL 0 μg/L 2 mL Blanc Tableau 1 : Schéma de distribution pour la préparation des normes. Lysate de cellule SH-SY5YREMARQUE : Le lysate cellulaire (SH-SY5Y) a servi de biomatricy pertinente fe(II)/(III) pour montrer la performance et la fiabilité de la méthode. Utilisez le lysate à partir d’expériences précédemment en cours d’exécution16. Suivez cette préparation de lysate de cellules en évitant les changements de pH ou les produits chimiques qui pourraient affecter l’équilibre redox. Utiliser un tampon de lyse par radioimmunoprécipitation (RIPA) modifié (PBS pH 7.4, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 1 % de NP-40), en évitant les chélateurs métalliques (tels que l’EDTA), les agents réducteurs (tels que la TNT, 2-Mercaptoéthanol) et les détergents anéoniques et les agents de complexage métallique (tels que le SDS) pour minimiser les altérations post-collecte du ratio Fe(II)/Fe(III). Travailler sous un N2-atmosphère inhibé l’oxydation par O2 de l’air ambiant et travailler sur la glace pour minimiser toute autoxidation jusqu’à ce que le lysate a été stocké dès que possible à -80 °C sous l’atmosphère d’azote. 3. Mise en place d’instruments de trait d’union de CE à ICP-MS Mettre en place l’instrument d’électrophorèse capillaire.REMARQUE : Pour cette section, le lecteur est principalement référé au manuel de l’instrument respectif disponible en laboratoire. Installez un capillaire d’une longueur appropriée pour atteindre de la fiole d’entrée de l’instrument CE au nébuliseur de l’ICP-MS. Installez le capillaire uniquement du côté de l’entrée et conduisez-le à l’extérieur de l’instrument vers l’interface CE-ICP-MS.REMARQUE : Pour le trait d’union CE à ICP-MS, dans ce protocole, un capillaire de silice fusionné de 90 cm (ID 50 μm) a été installé selon la description générale de configuration instrumentale. En règle générale, des tailles capillaires de 70 à 100 cm seront nécessaires, selon la position des instruments en laboratoire. Désactiver le levage de sortie de l’instrument CE dans le logiciel pour un fonctionnement en douceur car il n’est pas utilisé lorsque le capillaire est dirigé à l’extérieur vers l’interface CE-ICP-MS. Installez un câble de déclenchement à partir du déclencheur de l’instrument CE pour déclencher l’instrument ICP-MS. Sélectionnez les positions pour toutes les solutions nécessaires (20 mM HCl, 0,05 mM HCl, 12% TMAH), les normes et les échantillons dans l’échantillon et les solutions rotor de l’instrument et définissez leurs positions dans le logiciel d’instrument comme d’habitude (voir le manuel de l’instrument). Choisissez la température du rotor et du capillaire à identique à 20 °C, comme étant identique à la température contrôlée du laboratoire.REMARQUE : Il n’y a pas de gradient de température aux parties capillaires à l’intérieur et à l’extérieur de l’instrument CE. Configurer l’instrument ICP-MS Optimisez l’instrument ICP-MS selon les procédures quotidiennes d’installation et d’exploitation des normes instrumentales. Utilisez le protocole du fabricant. Utilisez la technologie des cellules de réaction dynamique (RDC) avec NH3 comme gaz de la RDC, avec 0,6 mL/min NH3–flurate et valeur RPq = 0,45.NOTE: Pour la spéciation du fer, une méthode est programmée avec 56Fe, étant l’isotope fe le plus abondant (91,754% d’abondance relative), cependant, étant gravement interféré de la [40Ar16O]+ cluster. Un QUADRopole basé ICP-MS en mode standard est pratiquement aveugle et le détecteur en débordement à cet isotope. Avec les réglages ci-dessus (voir l’étape 3.2.2), des lignes de base basses et une sensibilité élevée sont atteintes (pour la détermination totale régulière du fer LOD dans la gamme faible ng/L est atteint). Choisissez un réglage du temps d’habitation par isotope à 50 ms pour surveiller même les pics d’apparition pointus et courts pendant la séparation ce. Programmez la méthode ICP-MS qui sera lancée par l’instrument CE. Configurer l’interface CE-ICP-MSREMARQUE : Il existe principalement deux options pour relier le ce-capillaire à l’ICP-MS. Suivez les descriptions fournies sur l’installation si une interface commerciale est utilisée. Ce protocole utilise une interface simple et maison basée sur une publication précédente après modifications20. Les questions clés sont une nébulisation efficace avec peut-être moins de dilution de l’efflux capillaire en dehors de l’adoption du flux global à nébuliseur pour la meilleure nébulisation. En outre, la minimisation d’un flux d’aspiration par la séparation capillaire causée par l’auto-aspiration du nébuliseur, et la connexion électrique de l’électrode de sortie à la terre à l’extrémité capillaire sont obligatoires.Sélection des nébuliseurs Utilisez un nébuliseur concentrique à faible volume d’auto-aspiration (p. ex., 100 μL/min) qui s’inscrit dans une chambre de pulvérisation à faible volume.REMARQUE : La faible absorption ne provoquera qu’une dilution modérée de l’efflux capillaire parallèle à la nébulisation encore optimisée. La connexion électrique de l’électrode de sortie est réalisée par un flux d’électrolyte autour de l’électrode de sortie et autour de l’extrémité capillaire. Utilisez l’auto-aspiration du nébuliseur pour minimiser l’aspiration à travers le capillaire de séparation et pour l’adoption du débit à la valeur optimale requise par le nébuliseur. Préparez les pièces suivantes du tableau 2 pour monter cette interface maison. Configuration de l’interface simpleREMARQUE : Utilisez la figure 1 pour suivre la description du montage de pièce pour l’interface simple. Les chiffres de la figure 1 et du texte suivant se réfèrent aux chiffres du tableau 2. Commencez à monter l’interface en connectant les deux connecteurs Luer femelles à 3 voies (no 3) à un connecteur Luer à cône mâle (no 4). Connectez l’extrémité gauche de la barre Luer 3 voies inférieure au connecteur mâle et à la connexion médiane du Luer 3 voies supérieur. Placer un tube de 1 cm (no 1) sur le fil pt (no 7) et un tube de silicone de 1 cm (no 5) sur le dernier et la buse d’un connecteur Luer mâle (no 2). Fixez l’assemblage à la connexion moyenne du connecteur Luer 3 voies inférieur (no 3) par rotation de vis typique de Luer. Poussez un tube de 1 cm (No.1) sur l’extrémité de sortie du capillaire CE et placez-le à environ 8-9 cm de l’extrémité. Placer un tube de silicone de 1 cm (no 5) sur le dernier et la buse d’un connecteur Luer mâle (no 2). Placez l’ensemble de l’ensemble à partir de la gauche à travers la barre du connecteur 3 voies-T supérieur et fixez le connecteur Luer mâle et l’extrémité gauche du connecteur femelle 3 voies Luer (no 3) par rotation de vis typique de Luer. Fixer le tube de silicone de 25 cm (no 5) à la buse d’un connecteur Luer mâle (no 2) et fixer l’ensemble à l’extrémité inférieure (droite) de la barre à partir du connecteur Luer 3 voies inférieur (no 3) par rotation de vis typique de Luer. Prenez le tube de silicone de 1 cm (no 6) et poussez-le 5 mm sur l’extrémité du nébuliseur étroitement tandis que le deuxième connecteur mâle de cône de Luer (no 4) est étroitement branché dans la partie saillante du tube de silicone. Déplacez la partie d’interface montée ci-dessus par la suite avec le capillaire CE saillant au cône mâle au nébuliseur. Insérez soigneusement le capillaire CE à travers le cône mâle et plus loin à travers la partie plus large du capillaire nébuliseur jusqu’à ce que ce dernier se rétrécit. Étant donné que la longueur saillante du capillaire a été choisie convenablement, le connecteur femelle supérieur 3 voies Luer s’adapte maintenant étroitement au cône mâle. Corriger la longueur de la longueur capillaire saillante si nécessaire, en déplaçant le capillaire (avant/arrière) au tube (no 1) lorsque vous entrez dans l’interface auto-faite.REMARQUE : La position optimale du capillaire CE au début du capillaire du nébuliseur n’est pas trop critique. Cependant, ne poussez pas le capillaire CE trop près de la partie étroite du capillaire nébuliseur. Cela pourrait entraver ou bloquer le flux d’électrolyte de sortie. En outre, cela interromprait la connexion électrique à l’électrode de sortie et augmenterait l’aspiration par le capillaire CE, ce qui entraînerait une séparation perturbée. À son tour, ne gardez pas l’extrémité capillaire CE trop loin du capillaire nébuliseur depuis lors, les pics séparés pointus seraient élargis et la résolution sera perdue. Utilisez une lentille pour identifier la meilleure position.REMARQUE : La figure 1 (en bas à droite) montre la position optimale du ce-capillaire à l’intérieur du nébuliseur. Figure 1 : Schématique et montage de l’interface CE-ICP-MS. Le schéma identifie les pièces uniques pour le montage par étapes de l’interface CE-ICP-MS simple et bon marché. La fenêtre montre une photo du positionnement optimal du ce-capillaire dans le nébuliseur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. non. Partie utilisé pour 1 Tubes (code couleur vert-orange), 2 x ca. 1 cm fixation de l’électrode capillaire et de sortie CE à Luer-pièces et de garder serré 2 Luer, mâle, 3 x, adapté pour les tubes en silicone ID de 1,6 mm connexion du tube de silicone à l’électrolyte de sortie et comme aide pour fixer l’électrode capillaire ce et pt-fil 3 3 voies-Luer, femelle, 2 x T-pieces pour connecter l’électrode, le flux capillaire et de sortie aspirée 4 Cône de Luer, mâle, 2 x reliant les femelles Luers les unes aux autres et à nébuliseur 5 Tube en silicone, ID de 1,6 mm, mur de 0,8 mm, 2 x 1 cm, 1x ca. 25 cm a) 1 cm; collant ce capillaire à l’interface,b) 1 cm; collant Pt-wire à l’interfacec) 25 cm; connexion de la fiole électrolyte de sortie à l’interface 6 Tube en silicone, ID de 3 mm, mur de 1,2 mm, ca.1 cm collant cône Luer à nébuliseur 7 Fil de platine Électrode de sortie Tableau 2 : Pièces pour la construction de l’interface CE-ICP-MS simple et auto-fabriquée. Les chiffres se réfèrent également à la figure 1 et à la description dans le texte. 4. Préparation à la mesure REMARQUE : Avant la mesure, le capillaire doit être rincé avec une solution alcaline forte (ici : 12 % de TMAH) pour le nettoyage, puis rempli d’électrolyte de fond. Pour une meilleure séparation, un sandwich tampon d’empilage est construit autour de l’échantillon en fonction de la conductivité et des gradients de pH. Le tableau 3 résume les étapes de préparation consécutives du capillaire, qui sont traitées automatiquement par l’instrument selon la méthode programmée: Étape-Non Étape Chimique Condition   Préparation de la colonne CE Préparation 1 Nettoyage capillaire 12 % TMAH 4 bar, 1 min. Préparation 2 Purge capillaire avec électrolyte de fond 20 mM HCl 4 bar, 1 min. Préparation 3 Empilage : électrolyte de premier plan 12 % TMAH 150 mbar, 3 s Préparation 4 Injection Échantillon 150 mbar, 3 s Préparation 5 Empilage : fin de l’électrolyte 0,05 mM HCl 150 mbar, 3 s Tableau 3 : Étapes de préparation capillaire avant la mesure. Ces étapes sont programmées avec le logiciel du système CE dans la méthode CE et comprennent l’injection d’échantillons pressurisés et l’accumulation d’un « sandwich d’empilage » autour de l’échantillon. Programmez une méthode CE, qui exécute consécutivement les étapes données au tableau 3. Définissez un exemple de table et de séquence dans le logiciel CE et copiez cette séquence également dans le logiciel ICP-MS. 5. Mesure et évaluation des données Démarrez la méthode à l’instrument CE. Après la préparation programmée et le remplissage du capillaire, la mesure commence automatiquement dès que le flacon d’entrée, contenant 20 mM HCl, est en position à l’entrée capillaire. Le « start-trigger » est envoyé à l’ICP-MS, qui commence la surveillance en ligne des isotopiques Fe.REMARQUE : La séparation utilise une tension de +25 kV. La longueur prolongée du capillaire, nécessaire pour relier l’instrument CE à l’ICP-MS, entraîne une augmentation inutile du temps de séparation. Par conséquent, la séparation est soutenue par une basse pression de 250 mbar à l’entrée. L’électrolyte auto-aspiré à la sortie est de 5 mM HCl. L’analyse totale dure 3 minutes pour les échantillons ayant une conductivité modérée. Dans la fenêtre de signal du logiciel ICP-MS, l’électrophérogramme peut être observé pendant la course. À la fin de chaque échantillon, deux fichiers de données sont générés automatiquement, l’un uniquement accessible à partir d’un logiciel d’instrument à partir d’une banque de données interne, un second dans le dossier d’exportation sous le format « xl » ou « tx », accessible par fonction d’importation à partir d’un logiciel de chromatographie régulière. Reportez-vous au manuel logiciel de l’instrument ICP-MS pour l’exportation des fichiers dans un logiciel de chromatographie.