Opstelling van capillaire elektroforese-inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (CE-ICP-MS) voor kwantificering van ijzerrederoxsoorten (Fe(II), Fe(III))

LET OP: De methode maakt gebruik van zoutzuur (HCl, beginnende verdunningen van ultrapure, concentratie 1 M) en tetramethylammoniumhydroxide (TMAH, beginnende verdunningen van ultrapure, concentratie 25%). Beide stoffen zijn sterk corrosief. Gebruik huid- en oogbescherming. 1. Voorbereiden van elektrolyten Bereiding van HCl-elektrolyten: achtergrondelektrolyt (20 mM HCl), uitlaatelektrolyt (5 mM HCl) en terminerend elektrolyt (0,05 mM HCl) Bereid 20 mM HCl in een kolf van 100 mL: Pipette 2 mL van 1 M HCl in de kolf, vul tot de markering met ultrazuiver water en schud zachtjes. Bereid 5 mM HCl in een kolf van 100 mL: Pipette 500 μL van 1 M HCl in de kolf, vul tot de markering met ultrazuiver water en schud zachtjes. Bereid 0,05 mM HCl in twee stappen: Pipette 1 mL van 20 mM HCl in een kolf van 100 mL, en vul vervolgens tot het merk met ultrazuiver water en schud zachtjes. Vervolgens pipet 2,5 mL van de laatste oplossing in een 15 mL conische buis (Tabel van materialen) en voeg 7,5 mL ultrazuiver water, dan zachtjes schudden. Voorbereiden van toonaangevende elektrolyt 12% TMAH in een 15 mL conische buis: Pipette 4.8 mL van 25% TMAH in de buis, voeg 5,2 mL ultrazuiver water toe en schud zachtjes.OPMERKING: De 12% TMAH wordt gebruikt om de capillaire vóór elke run te zuiveren en schoon te maken en als een toonaangevend elektrolyt voor het geïnjecteerde monster). 2. Bereiding en opslag van normen en monsters Normen Weeg voor Fe(II) 35,61 mg Fe(II)Cl2·4H2O in een kolf van 100 mL en vul tot de 100 mL-markering met ultrazuiver water voor een voorraadconcentratie van 100 mg Fe(II)/L. Schud zachtjes tot volledige ontbinding. Weeg voor Fe(III) 29,04 mg Fe(III)Cl3 in een kolf van 100 mL en vul tot de 100 mL-markering met ultrazuiver water voor een concentratie van 100 mg Fe(III)/L. Schud zachtjes tot volledige ontbinding. Verdun elke standaardoplossing volgens tabel 1 om de werkstandaardoplossingen voor te bereiden.LET OP: Na het voorbereiden van de dagelijkse voorraadoplossingen van de 100 mg/L-voorraadoplossing, moet deze bevroren worden opgeslagen. Na de voorbereiding van de dagelijkse normen volgens tabel 1moet de 1 mg/L-voorraadoplossing in 1,5 mL-volumes worden ingedeeld en bevroren (het best zonder lucht links bovenop) in 1,5 mL-buizen worden opgeslagen. Voor elke nieuwe dag wordt één dagelijkse voorraadkap ontdooid voor de voorbereiding van de dagelijkse normen en na gebruik ingetrokken. Startconcentratie Pipettingvolume Vul met Milli-Q water Resulterende concentratie Eindvolume Gebruik van de oplossing 100 mg/L 50 μL 4950 μL 1 mg/L 50 mL Dagelijkse voorraadoplossing 1 mg/L 200 μL 1800 μL 100 μg/L 2 mL Standaard 100 μg/L 1 mg/L 100 μL 1900 μL 50 μg/L 2 mL Standaard 50 μg/L 1 mg/L 50 μL 1950 μL 25 μg/L 2 mL Standaard 25 μg/L 1 mg/L 25 μL 1975μL 12,5 μg/L 2 mL Standaard 12,5 μg/l 1 mg/L 20 μL 1980μL 10 μg/L 2 mL Standaard 10 μg/L 0 2000 μL 0 μg/L 2 mL Lege Tabel 1: Pipettingregeling voor de voorbereiding van de normen. SH-SY5Y cellysaatOPMERKING: Het cellysaat (SH-SY5Y) diende als Fe(II)/(III)-relevante bio-matrix om de prestaties en betrouwbaarheid van de methode aan te tonen. Gebruik lysaat van eerder uitgevoerde experimenten16. Volg deze cellysate voorbereiding het vermijden van pH veranderingen of chemische stoffen die van invloed kunnen zijn redox balans. Gebruik een aangepaste radioimmunoprecipitatietest (RIPA) lysebuffer (PBS pH 7.4; 0,5% natriumdeoxycholaat, 1% NP-40), het vermijden van metalenchelatoren (zoals EDTA), reducerende middelen (zoals DTT, 2-Mercaptoethanol) en anionische oppervlakteactieve detergenten en metaalcomplexerende middelen (zoals SDS) voor het minimaliseren van wijzigingen na de inzameling van de Fe(II)/Fe(III) ratio. Werk onder een N2-atmosfeer geremd oxidatie door O2 uit de omgevingslucht en werken op ijs om eventuele autoxidatie te minimaliseren totdat het lysaat werd opgeslagen zo spoedig mogelijk bij -80 °C onder de stikstofatmosfeer. 3. Vaststelling van instrumenten voor afbreking van CE aan ICP-lidstaten Stel het capillaire elektroforese-instrument in.OPMERKING: Voor deze sectie wordt de lezer voornamelijk verwezen naar de handleiding van het betreffende instrument dat in het laboratorium beschikbaar is. Installeer een capillair met een geschikte lengte om van de inlaatflaubl van het CE-instrument tot de vernevelaar van ICP-MS te reiken. Installeer de capillaire alleen aan de inlaatzijde en leid deze buiten het instrument naar de CE-ICP-MS-interface.OPMERKING: Voor het afbreken van CE tot ICP-MS werd in dit protocol een 90 cm gesmolten silica capillair (ID 50 μm) geïnstalleerd volgens de algemene instrumentale setupbeschrijving. Meestal zijn capillaire maten van 70−100 cm nodig, afhankelijk van de positie van de instrumenten in het laboratorium. De-activeer de uitlaatlift van het CE-instrument in de software voor een soepele werking, omdat deze niet in gebruik is wanneer de capillaire buiten naar de CE-ICP-MS-interface wordt geleid. Installeer een triggerkabel van CE-instrument trigger-OUT om het ICP-MS-instrument in te triggeren. Selecteer posities voor alle benodigde oplossingen (20 mM HCl, 0,05 mM HCl, 12% TMAH), normen en monsters in de sample & solutions rotor van het instrument en definieer hun posities in de instrumentsoftware zoals gebruikelijk (raadpleeg de handleiding van het instrument). Selecteer de rotor- en capillaire temperatuur die identiek is bij 20 °C, identiek aan de gecontroleerde laboratoriumtemperatuur.OPMERKING: Er treedt geen temperatuurgradiënt op aan de capillaire delen binnen en buiten het CE-instrument. Het ICP-MS-instrument instellen Optimaliseer het ICP-MS instrument volgens de dagelijkse instrumentale standaard setup en bedieningsprocedures. Gebruik het protocol van de fabrikant. Gebruik dynamische reactieceltechnologie (DRC) met NH3 als DRC-gas, met 0,6 mL/min NH3–flowrate en RPq-waarde = 0,45.OPMERKING: Voor ijzerspesiatie is een methode geprogrammeerd met 56Fe, de meest voorkomende Fe-isotoop (91,754% relatieve overvloed), maar wordt ernstig verstoord door de [40Ar16O]+ cluster. Een viervoudige ICP-MS in standaardmodus is praktisch blind en de detector in overloop bij deze isotoop. Met de bovenstaande instellingen (zie stap 3.2.2) worden lage basislijnen en hoge gevoeligheid bereikt (voor regelmatige totale ijzerbepaling wordt LOD in het lage ng/L-bereik bereikt). Kies een verblijfstijdinstelling per isotoop op 50 ms voor het monitoren van zelfs scherpe en kort verschijnende pieken tijdens CE-scheiding. Programmeer de ICP-MS methode die door het CE-instrument wordt gestart. De CE-ICP-MS-interface instellenOPMERKING: Er zijn voornamelijk twee opties voor het aansluiten van de CE-capillair op de ICP-MS. Volg de opgegeven beschrijvingen over de installatie als een commerciële interface wordt gebruikt. Dit protocol maakt gebruik van een eenvoudige, zelfgemaakte interface op basis van een eerdere publicatie na wijzigingen20. Belangrijke kwesties zijn een efficiënte verneveling met mogelijk minder verdunning van de capillaire efflux afgezien van de goedkeuring van de totale stroomsnelheid tot vernevelaar voor de beste verneveling. Ook de minimalisering van een zuigstroom door het scheiden van capillair veroorzaakt door de zelf-aspiratie van vernevelaar, en de elektrische verbinding van de geaarde uitlaat elektrode capillaire einde zijn verplicht.Vernevelaarselectie Gebruik een concentrische vernevelaar met een laag zelfpiratievolume (bijvoorbeeld 100 μL/min) dat in een spuitkamer met een laag volume past.LET OP: De lage opname zal leiden tot slechts matige verdunning van capillaire efflux parallel aan de nog steeds geoptimaliseerde verneveling. De elektroverbinding van de uitlaatelektrode wordt verwezenlijkt door een elektrolytstroom rond de uitlaatelektrode en rond het capillaire eind. Gebruik de zelfaspiratie van de vernevelaar om de zuigkracht door de scheidende capillaire te minimaliseren en voor de goedkeuring van de stroomsnelheid tot de optimale waarde die de vernevelaar nodig heeft. Bereid de volgende onderdelen van tabel 2 voor om deze zelfgemaakte interface te monteren. Installatie van de eenvoudige interfaceOPMERKING: Gebruik figuur 1 om de beschrijving van de montage van delen te volgen voor de eenvoudige interface. De getallen in figuur 1 en in de volgende tekst verwijzen naar de getallen in tabel 2. Begin met het monteren van de interface door de twee 3-weg vrouwelijke Luer-connectors (nr. 3) aan te sluiten met een mannelijke cone Luer-connector (nr. 4). Sluit het linker uiteinde van de onderste 3-weg Luer bar aan op de mannelijke connector en dat aan de middelste verbinding van de bovenste 3-weg Luer. Leg een buis van 1 cm (nr. 1) over de Pt-wire (nr. 7) en een 1 cm siliconen buis (nr. 5) over de laatste en het mondstuk van een mannelijke Luer connector (nr. 2). Bevestig de montage op de middelste verbinding van de onderste 3-weg Luer connector (nr. 3) door Luer-typische schroefrotatie. Duw een buis van 1 cm (nr.1) over het uitgangseind van de CE-capillaire en plaats deze ongeveer 8-9 cm van het einde. Zet een siliconen buis van 1 cm (nr. 5) boven de laatste en het mondstuk van een mannelijke Luer-connector (nr. 2). Zet de hele montage van links door de bar van de bovenste 3-way-T connector en bevestig de mannelijke Luer connector en het linkerkant van de vrouwelijke 3-weg Luer connector (nr. 3) door Luer-typische schroef rotatie. Bevestig de siliconen buis van 25 cm (nr. 5) aan het mondstuk van een mannelijke Luer-connector (nr. 2) en bevestig de hele montage aan de onderkant (rechts) van de bar van de onderste 3-weg Luer-connector (no.3) door Luer-typische schroefrotatie. Neem de siliconen buis van 1 cm (no.6) en duw deze 5 mm strak over het uiteinde van de vernevelaar, terwijl de tweede mannelijke Luer-kegelconnector (nr. 4) stevig in het uitstekende deel van de siliconenbuis is aangesloten. Verplaats het bovenbemonteerde interfacedeel vervolgens met de uitstekende CE-capillaire naar de mannelijke kegel bij de vernevelaar. Steek de CE-capillaire voorzichtig door de mannelijke kegel en verder door het bredere deel van de vernevelaar capillaire totdat de laatste wordt smal. Gezien het feit dat de uitstekende lengte van de capillaire voldoende werd gekozen, past de bovenste vrouwelijke 3-weg Luer connector nu ook goed op de mannelijke kegel. Corrigeer indien nodig de lengte van de uitstekende capillaire lengte door de capillaire (voorwaarts/achteruit) bij het betreden van de zelfgebouwde interface naar de buis te bewegen.LET OP: De optimale positie van de CE capillaire aan het begin van de vernevelaar capillaire is niet al te kritisch. Duw de CE-capillaire echter niet te dicht bij het smalle deel van vernevelaarcapillaire. Dit kan de elektrolytstroom van de uitlaat belemmeren of blokkeren. Ook zou dit de elektrische verbinding met de uitlaatelektrode onderbreken en zou de zuigkracht door CE-capillaire verhogen, wat resulteert in een verstoorde scheiding. Houd op zijn beurt het CE-capillaire uiteinde niet te ver weg van vernevelaarcapillaire, omdat dan scherpe gescheiden pieken zouden worden verbreed en resolutie verloren zal gaan. Gebruik een lens om de beste positie te identificeren.LET OP: Figuur 1 (rechtsonder) toont de optimale positie van CE-capillair in de vernevelaar. Figuur 1: Schematisch en montage van de CE-ICP-MS interface. Het schema identificeert de afzonderlijke onderdelen voor stapsgewijze montage van de eenvoudige en goedkope CE-ICP-MS interface. Het venster toont een foto van een optimale positionering van de CE-capillair in de vernevelaar. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. №. Deel gebruikt voor 1 Slang (groen-oranje kleurcode), 2 x ca. 1 cm ce-capillaire en uitlaatelektrode bij Luer-onderdelen bevestigen en strak houden 2 Luer, man, 3 x, geschikt voor 1,6 mm ID siliconen buizen aansluiting van siliconen buis op uitlaat elektrolyt en als hulpmiddel bij de vaststelling van CE capillair en Pt-wire elektrode 3 3-way-Luer, vrouwelijk, 2 x T-stukken om elektrode, capillaire en aangezogen uitlaatstroom aan te sluiten 4 Luer kegel, man, 2 x het verbinden van vrouwelijke Luers met elkaar en aan vernevelaar 5 Siliconen buis, 1,6 mm ID, 0,8 mm muur, 2 x 1 cm, 1x ca. 25 cm a) 1cm; het inbedichten van CE-capillair aan de interface,b) 1cm; inberinging Pt-wire naar interfacec) 25 cm; verbinding van uitlaatelektrolytkolf naar interface 6 Siliconen buis, 3 mm ID, 1,2 mm muur, ca.1 cm het dichten van Luer kegel aan vernevelaar 7 Platina draad Uitlaatelektrode Tabel 2: Onderdelen voor het bouwen van de eenvoudige, self-made CE-ICP-MS interface. De getallen verwijzen ook naar figuur 1 en beschrijving in de tekst. 4. Voorbereiding op de meting OPMERKING: Vóór de meting moet de capillaire worden gespoeld met een sterke alkalische oplossing (hier: 12% TMAH) voor reiniging en vervolgens gevuld met achtergrondelektrolyt. Voor een betere scheiding wordt rond het monster een stapelbuffer sandwich gebouwd op basis van geleidbaarheid en pH-gradiënten. Tabel 3 bevat een overzicht van de opeenvolgende bereidingsstappen van de capillaire, die automatisch door het instrument worden verwerkt volgens de geprogrammeerde methode: Stap-Nee Stap Chemische Voorwaarde   Voorbereiding van de CE-kolom Prep 1 Capillaire reiniging 12 % TMAH 4 bar, 1 min. Prep 2 Capillaire zuivering met achtergrondelektrolyt 20 mM HCl 4 bar, 1 min. Prep 3 Stapelen: toonaangevende elektrolyt 12 % TMAH 150 mbar, 3 s Prep 4 Injectie Monster 150 mbar, 3 s Prep 5 Stapelen: het beëindigen van elektrolyt 0,05 mM HCl 150 mbar, 3 s Tabel 3: Capillaire voorbereidingsstappen vóór de meting. Deze stappen zijn geprogrammeerd met de CE-systeemsoftware in de CE-methode en omvatten onder druk genomen monsterinjectie en de opbouw van een “stapelende sandwich” rond het monster. Programmeer een CE-methode, die achtereenvolgens de stappen uitvoert die in tabel 3zijn gegeven. Definieer een voorbeeldtabel en volgorde in CE-software en kopieer deze reeks ook in ICP-MS-software. 5. Meet- en gegevensevaluatie Start de methode bij CE-instrument. Na het geprogrammeerd prepareren en vullen van de capillaire, begint de meting automatisch zodra de inlaatbladl, met 20 mM HCl, op zijn plaats is bij capillaire inlaat. De “Start-trigger” wordt verzonden naar de ICP-MS, die de on-line monitoring van Fe-isotopen start.LET OP: De scheiding maakt gebruik van een spanning van +25 kV. De langere lengte van het capillair, dat nodig is om het CE-instrument aan te sluiten op ICP-MS, zorgt ervoor dat de scheidingstijd onnodig wordt verhoogd. Daarom wordt de scheiding ondersteund door een lage druk van 250 mbar bij inlaat. Het zelf aangezogen elektrolyt bij de uitlaat is 5 mM HCl. De totale analyse duurt 3 minuten voor monsters met matige geleidbaarheid. In het signaalvenster van de ICP-MS software kan het elektropherogram tijdens de looppas worden waargenomen. Aan het einde van elk voorbeeld worden automatisch twee gegevensbestanden gegenereerd, één alleen toegankelijk via instrumentsoftware van interne gegevensbank, een tweede in de exportmap als “.xl” of “.txt”-formaat, toegankelijk per importfunctie van reguliere chromatografiesoftware. Raadpleeg de softwarehandleiding van het ICP-MS-instrument voor het exporteren van de bestanden naar chromatografiesoftware.