这种铁氧化氧光谱法基于毛细管电泳-电感耦合等离子质谱法,样品堆叠与短分析相结合。该方法可快速分析铁氧化还原物种的定量限制,用于各种组织和生物流体样品。
铁代谢的病痛是许多疾病的病理生理框架,包括癌症和几种神经退行性疾病。过量的铁会导致自由氧化活性Fe(II),并可对细胞内产生破坏性影响,如氧化应激(OS)和称为铁氧体(FPT)的脂质过氧化死亡。因此,铁(II)和铁(三)铁的定量测量(而不是总铁测定)是更深入地了解这些有害过程的关键。由于Fe(II)/(III)测定可能因相关样品(如脑脊液(CSF)的快速氧化还原状态变化和低浓度而受阻,因此应提供快速分析并提供低定量限(LOQ)的方法。毛细管电泳 (CE) 具有快速 Fe(II)/Fe(III) 分离的优势,无需固定相,这可能会干扰氧化还原平衡或引起分析剂粘附。CE 与电感耦合等离子质谱仪 (ICP-MS) 相结合,作为探测器,可进一步提高检测灵敏度和选择性。该方法采用20 mM HCl作为背景电解质,电压为+25 kV。通过电导率-pH-堆叠,提高了峰值形状和浓度检测限值。为了减少56[ArO],在+动态反应单元(DRC)模式下操作,NH3作为反应气体。 56该方法实现了3μg/L的检测极限(LOD), 由于堆叠,在不妨碍分离但改善LOD的情况下,可增加注塑量。与峰值区域相关的校准是线性的,高达 150 μg/L。测量精度为 2.2%(Fe(III))至 3.5%(Fe(II)。两个物种的迁移时间精度为<3%,以人类神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞的1:2稀释的体质确定。标准添加的恢复实验显示精度为97%Fe(III)和105%Fe(II)。在像CSF这样的真实生物样品中,迁移时间可能因电导率(即盐度)而异。因此,峰值标识通过标准添加进行确认。
今天,最明显的是,铁的氧化应激(OS)在多种疾病中起着至关重要的作用,特别是在神经退行性脑部疾病,如阿尔茨海默氏症和帕金森病,以及癌症1,2,3,4。2,3,41操作系统与氧化还原型产品(II)/Fe(III)的状态和平衡密切相关。虽然Fe(III)是氧化还原不活性的,Fe(II)通过催化H2O2分解,从羟基基生产和膜脂质过氧化5,6,强效产生活性氧物种(ROS)。在分子水平上,Fe(II)生成的ROS和过氧化物磷脂是蛋白质、脂质和DNA7,8完整性的强攻击。这种有害的细胞功能障碍被证明诱导线粒体功能障碍与减少ATP含量9,甚至可以触发程序性坏死细胞死亡,称为铁生病(FPT)10,11。10,11因此,定量Fe(II)/(III)红氧化物物种在广泛的红氧化物相关疾病中具有突出的重要性。
,化学物种化是研究微量元素生物作用和代谢的成熟工具,在一般7、8,8以及神经退行性疾病12、13、14、15、16、17等。12,13,14,15,1617文献中发现的Fe-redox光谱方法通常基于液相色谱(LC)分离。一些文献使用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)作为元件选择性检测器。但是,在常规 LC 工作中,运行之间需要过多的清除时间。更成问题的是,LC 列的批处理变化强制在每个列更改后重新优化洗脱条件。这些问题阻碍了高吞吐量。为了获得可接受的可靠性和再次彻底评估该方法,需要额外的时间。
为了规避这些缺点,本文提出了一种基于毛细管电泳电感耦合等离子质谱(CE-ICP-MS)的Fe(II)/Fe(III)氧化还原光谱的方法。与 LC 18 相比,CE具有各种优势。毛细管没有固定相位,因此取决于(几乎)不依赖于批次标识。老化或阻塞时,它们被快速替换,显示通常不变的性能。样品之间的清除和清洗步骤有效且短,每个样品的分析时间也很短。
提出的方法是可靠的,有好的功绩。作为一种证明,该方法应用于人类多巴胺神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞乳酸盐,一种在神经退化和癌症研究中重要的样本类型。
由于铁在OS进展中起着突出的作用,从而促进线粒体功能障碍或FTP,本文提出了一种基于CE-ICP-MS的多种定量方法,用于同时进行Fe(II)/Fe(III)的物种形成,并在细胞间乳酸盐中进行了示范。该方法提供较短的分析时间和优点(LOQ、精度、恢复)的数字,适用于与铁氧化氧物种形成相关的样品,具体用于神经退行和癌症研究。与以往基于LC的方法相比,这种基于CE的方法实际上与列批处理和以前观察到的LC柱更改后可重复性问题无关。每次跑步前的毛细管准备为 <4 分钟,每个样品的分析时间,适量盐度长达 3 分钟。除了分子电荷和大小外,CZE 中的迁移时间取决于样品塞的电导率,这会导致迁移时间变化或当样品本身对电导率产生显著影响时发生转移。这种迁移时间的变化在毛细管电泳中是众所周知的。这是一个CZE的不然问题,从文学21,22,中知道。标准和SH-SY5Y细胞异物具有中度和均匀的导电性。因此,迁移时间变化不大,精度高。然而,对于电导率高的样品,可观察到长达 5 分钟的长时间迁移时间。因此,建议增加标准物种,以明确物种识别。
铁氧化还原物种的一个关键问题是物种稳定性(即维持Fe(II)/(III)平衡)在样品制备8,13。8,不适当的 pH 或溷合化学品以及不适当的储存条件,如氧气(空气)与样品接触或深冻储存中断,很容易改变 Fe(II)/(III) 平衡。因此,对于SH-SY5Y细胞解液的制备,选择一种解液缓冲液,不带任何溷合化学品,生理pH值,但在样品制备过程中,在样品容器中应用惰性气体覆盖,并直接深度冷冻。
在文献中,人们可以找到半定量的方法来监测Fe(II)。为了更好地了解铁在氧化应激中的作用,几个研究小组开发了Fe(II)特异性探针,以半定量监测和可视化铁在体外异常升高。然而,重要的是要注意,这种探测器不考虑Fe(III),不量化,但只报告”更多”或”少”Fe(II)。迄今为止,只有几个生物标志物可用于确定OS和FPT,这是因为缺乏可靠的方法同时量化Fe(II)/Fe(III)红氧化物物种23,24。23,考虑到这一点,提出的方法 – 促进快速定量的Fe(III)和Fe(II)在一次运行 – 可能成为一个有希望的工具,加深对铁依赖分子过程的洞察力。
The authors have nothing to disclose.
VV得到了哥廷根大学医学中心校外研究补助金(Forschungsfürderung)和埃塞·克吕纳-弗雷塞纽斯-斯蒂夫通的埃尔斯·克吕纳研究项目的支持。
CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
FeCl3 | Merck | 803945 | |
Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
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