Uma plataforma de espectrometria de massa de troca de hidrogênio (HDX-MS) para investigar enzimas biossintéticas de peptídeos

Proteínas são moléculas estruturalmente dinâmicas que amostram diferentes conformações em escalas de tempo que vão desde vibração de ligação em escala femtosegundo até rearranjos de domínios proteicos inteiros que podem ocorrer ao longo de muitos segundos¹. Estas flutuações conformais são frequentemente aspectos críticos da função enzima/proteína. Por exemplo, alterações conformais induzidas pela ligação de ligasão são muitas vezes criticamente importantes para a modulação da função enzimática, seja organizando resíduos ativos do local necessários para a catálise, definindo locais de ligação de substrato em mecanismos cinéticos sequenciais, protegendo intermediários reativos do ambiente ou modulando a função enzimática através de redes alostêmicas. Estudos recentes também mostraram que a dinâmica conformacional pode ser conservada ao longo da evolução e que perturbações a movimentos moleculares conservados podem ser correlacionadas com mudanças na especificidade do substrato e no surgimento de novas funções enzimárias^2,3.

Nos últimos anos, a espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério (HDX-MS) tem emergido rapidamente como uma técnica poderosa para sondar como as paisagens conformais da proteína respondem a perturbações como ligadura ou mutagênese^4,5,6,7. Em um experimento típico hdx-ms(Figura 1), uma proteína de interesse é colocada em tampão preparado em D₂O, que desencadeia a substituição de prótons trocaveis de solventes por deuteria. A taxa de troca da moiety amida dos títulos de peptídeo depende fortemente do pH, da sequência local de aminoácidos, e do ambiente estrutural local da amida⁸. Amidas que estão engajadas em interações de ligação de hidrogênio (como as presentes em α-helices e β-folhas) trocam mais lentamente do que em meios em regiões não estruturadas da proteína que são expostas a solventes a granel. Assim, a extensão da captação do deutério é um reflexo da estrutura da enzima. Enzimas que são conformamente dinâmicas, ou que passam por transições estruturais sobre ligação ligante, seriam esperadas para produzir uma resposta HDX mensurável.

A base mecanicista para a taxa de câmbio lenta de uma amida estruturada é mostrada na Figura 2^5,8,9. Para se submeter ao HDX, a região estruturada deve primeiro amostrar transitoriamente uma conformação desdobrada, de tal forma que as moléculas de solvente que catalisam a troca de HDX através de um mecanismo químico ácido/base específico, tenham acesso ao amide tromável. Em última análise, as magnitudes relativas da taxa de câmbio química (k_chem) e as taxas de dobra e reagem(k_open e k_close) determinam a taxa HDX medida no experimento^5,8. A partir deste modelo cinético simples, é claro que a extensão da absorção do deutério refletirá a dinâmica conformacional subjacente (definida por k_open e k_close). A maioria dos experimentos HDX-MS são realizados em um fluxo de trabalho de baixo para cima onde, após a reação de troca, a proteína de interesse é digerida em peptídeos e a absorção do deutério por cada peptídeo é medida como um aumento na massa⁷. Dessa forma, o HDX-MS permite que perturbações para a dinâmica conformacional enzimária sejam mapeadas na escala espacial local dos peptídeos, permitindo que o pesquisador avalie como a perturbação altera a dinâmica em diferentes regiões da enzima de interesse.

As vantagens da abordagem HDX-MS para a dinâmica estrutural proteica elucidação são inúmeras. Em primeiro lugar, o método pode ser realizado com pequenas quantidades de proteína nativa ou em complexos proteicos em sistemas com estrutura quaternária¹⁰. Não é mesmo necessário que a preparação da enzima usada no ensaio seja altamente purificada^11,12, desde que o fluxo de trabalho HDX-MS de baixo para cima forneça um número suficiente de peptídeos confiantemente identificados que cobrem a sequência proteica de interesse. Além disso, o HDX-MS pode fornecer informações sobre a dinâmica conformacional em condições próximas de nativos sem a necessidade de rotulagem de proteínas específicas do local, como seria usado em estudos de fluorescência de moléculas únicas¹³, e não há limite de tamanho para o complexo proteico ou proteico que possa ser investigado (o que torna desafiadoras abordagens como ressonância magnética nuclear [NMR] espectroscopia)^7,14. Finalmente, métodos HDX-MS resolvidos pelo tempo podem ser empregados para estudar proteínas intrinsecamente desordenadas, que são difíceis de estudar com cristalografia de raios-X^15,16,17,18. A principal limitação do HDX-MS é que os dados são de baixa resolução estrutural. Os dados HDX-MS são úteis para apontar para onde a dinâmica conformacional está mudando e para revelar alterações conformais acopláveis, mas muitas vezes não fornecem muita visão do mecanismo molecular preciso que conduz a mudança observada. Avanços recentes na combinação de métodos de dissociação de captura de elétrons com dados de proteína HDX-MS mostraram-se promissores para mapear locais de troca para resíduos de aminoácidos^{únicos 19,}mas estudos bioquímicos e estruturais de acompanhamento ainda são frequentemente necessários para fornecer clareza aos modelos estruturais encaminhados pelos dados hdx-MS.

Abaixo, um protocolo detalhado para o desenvolvimento de um ensaio HDX-MS é apresentado²⁰. Os protocolos de preparação da amostra apresentados abaixo devem ser geralmente aplicáveis a qualquer proteína que exaque boa solubilidade em tampões aquosos. Métodos de preparação de amostras mais especializados e fluxos de trabalho HDX-MS estão disponíveis para proteínas do que precisam ser avaliados na presença de detergentes ou fosfolipídios^21,22,23,24. As configurações instrumentais para a coleta de dados HDX-MS são descritas para um espectrômetro de massa quadrúpole de alta resolução acoplado ao sistema de cromatografia líquida. Dados de complexidade e resolução semelhantes poderiam ser coletados em qualquer um dos vários sistemas de espectrometria de massa líquida (LC-MS) disponíveis comercialmente. Aspectos-chave do processamento de dados usando um pacote de software comercialmente disponível também são fornecidos. Também apresentamos diretrizes para coleta e análise de dados que são consistentes com as recomendações feitas pela comunidade HDX-MS mais ampla¹². O protocolo descrito é usado para estudar as propriedades estruturais dinâmicas do HalM2, uma sintetização lanthipeptide que catalisa a maturação multistep de um produto natural de peptídeo antimicrobiano²⁰. Ilustramos como o HDX-MS pode ser usado para revelar sites de ligação de substratos e propriedades alotésicas que iludiram a caracterização anterior. Vários outros protocolos sobre proteína HDX-MS foram publicados nos últimos anos^25,26. Juntamente com o presente trabalho, essas contribuições anteriores devem proporcionar ao leitor alguma flexibilidade no design experimental.