אימונולוקליזציה פלואורסצנטית של חלבונים ערבינוגלקטניים ופקטינים בחומת התא של רקמות הצמח
Summary
פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד החומר הצמחי לאימונולוקליזציה של חלבונים ופקטינים ערבינוגלקטניים קבוע, מוטבע בשרף אקרילי הידרופילי, חתוכה ומורכבת על מגלשות זכוכית. אנו מראים אפיטופים הקשורים לקיר התא יזוהו עם נוגדנים ספציפיים.
Abstract
פיתוח הצמח כרוך בהתאמות מתמידות של הרכב ומבנה דופן התא בתגובה לגירויים פנימיים וחיצוניים כאחד. קירות התא מורכבים מפוליסכרידים תאיים ולא צלולוסיים יחד עם חלבונים, תרכובות פנוליות ומים. 90% מקיר התא מורכב מפוליסכרידים (למשל, פקטינים) וחלבונים ערבינוגלקטים (AGPs). האימונולוקליזציה הפלואורסצנטית של אפיטופים גליקן ספציפיים בחלקים היסטולוגיים של הצמח נותרה כלי מרכזי לחשיפת שיפוץ של רשתות פוליסכריד בקיר, מבנה ורכיבים.
כאן, אנו מדווחים על הליך אימונולוקליזציה פלואורסצנטי אופטימיזציה לגילוי אפיטופים גליקן מ- AGPs ופקטינים ברקמות הצמח. קיבוע Paraformaldehyde / glutaraldehyde שימש יחד עם הטמעת LR-לבן של דגימות הצמח, המאפשר שימור טוב יותר של מבנה הרקמה והרכב. חלקים דקים של הדגימות המוטבעות שהושגו עם אולטרה מיקרוטום שימשו לאימונולוקליזציה עם נוגדנים ספציפיים. טכניקה זו מציעה רזולוציה רבה, ספציפיות גבוהה, ואת ההזדמנות לזהות אפיטופים גליקן מרובים באותה דגימה. טכניקה זו מאפשרת לוקליזציה תת-תאית של גליצנים ומזהה את רמת ההצטברות שלהם בקיר התא. זה גם מאפשר קביעת דפוסים מרחביים-זמניים של הפצת AGP ופסטין במהלך תהליכים התפתחותיים. השימוש בכלי זה עשוי בסופו של דבר להנחות כיווני מחקר ולקשר גליצנים לפונקציות ספציפיות בצמחים. יתר על כן, המידע המתקבל יכול להשלים מחקרים ביוכימיים וביטוי גנים.
Introduction
קירות תאי הצמח הם מבנים מורכבים המורכבים מפוליסכרידים וגליקופרוטאינים. קירות התא הם מבנים דינמיים ביותר שהארכיטקטורה, הארגון וההרכב שלהם משתנים בהתאם לסוג התא, לוקליזציה, שלב התפתחותי, גירויים חיצוניים ופנימיים1. חלבונים ערבינוגלקטנים (AGPs) ופקטינים הם מרכיבים חשובים של דופן תאי הצמח. AGPs הם חלבונים glycosylated מאוד פקטינים הם פוליסכרידים homogalacturonan אשר הרכב, כמות ומבנה להשתנות מאוד בשלבים התפתחותיים שונים של הצמח2,3,4. AGPs ומחקרי פקטין חשפו את מעורבותם במספר תהליכים צמחיים כגון מוות תאי מתוכנת, תגובה ללחצים אביוטיים, רבייה של צמחים מיניים, בין רבים אחרים5. רוב המחקרים הללו החלו עם מידע שהתקבל ממחקרי אימונולוקליזציה.
בהתחשב במורכבותו, חקר קירות התא דורש כלים רבים ושונים. זיהוי אפיטופים גליקן באמצעות נוגדנים חד שבטיים (mAbs) היא גישה חשובה כדי לפתור את התפלגות פוליסכריד וגליקופרוטאין לאורך מבנה זה. יש אוסף גדול של mAbs זמין כדי לזהות אפיטופים גליצן ואת הספציפיות של כל mAb הוא ללא הרף להיות משופר גם6. הטכניקה המתוארת כאן חלה על כל מיני הצמחים, והיא כלי מושלם להנחיית כיווני מחקר עתידיים שעשויים לכלול טכניקות יקרות ומורכבות יותר.
בטכניקה זו, נוגדנים ספציפיים הם מצומדים כימית צבעים פלואורסצנטיים כגון FITC (פלואורסצנטין isothiocyanate), TRITC (tetramethylrhodamine-5-(ו 6)-isothiocyanate) או כמה צבעי אלקסה פלואור. אימונופלואורסצנטיות מציעה מספר יתרונות, המאפשר לוקליזציה תת-תאית ברורה ומהירה של גליצנים שניתן לצפות בהם ישירות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה מאוד ספציפי ורגיש, שכן הכנת המדגם יכול להגן ביעילות על המבנה הטבעי של האנטיגן, גם אם קיים בכמויות נמוכות יותר. זה מאפשר זיהוי של אנטיגנים מרובים באותה מדגם והכי חשוב, מציע תוצאות באיכות גבוהה ויפה ויזואלית. למרות הכוח הרב שמציעים מחקרי אימונולוקליזציה פלואורסצנטיים, הם נחשבים לעתים קרובות כקשים לביצוע וליישם ככל הנראה בשל היעדר פרוטוקולים מפורטים המאפשרים הדמיה של השלבים השונים של ההליך. כאן, אנו מספקים כמה הנחיות פשוטות על איך לבצע טכניקה זו וכיצד להשיג תמונות באיכות גבוהה.
עבור הפרוטוקול המוצג כאן, יש לתקן ולהטבע תחילה דוגמאות באמצעות התיקון המתאים ביותר. למרות נחשב טכניקה זמן רב ומייגע יחסית, קיבעון נאות והטבעה של מדגם הצמח הוא המפתח כדי להבטיח מבחני אימונולוקליזציה מוצלחת. לשם כך, הרגיל ביותר הוא קיבעון כימי באמצעות קיבועים crosslinking, כמו אלדהידים. תיקונים חוצי קישורים יוצרים קשרים כימיים בין מולקולות של הרקמה, מייצבים ומקשיחים את המדגם. פורמלדהיד וגולדארלדהיד הם מתקנים מקשרים צולבים, ולפעמים נעשה שימוש בשילוב של שני התיקונים7. פורמלדהיד מציע שימור מבני נהדר של רקמות ולמשך פרקי זמן ממושכים, לייצר נסיגות רקמות קטנות ולהיות תואם immunostaining. Glutaraldehyde הוא תיקון חזק ויציב המשמש בדרך כלל בשילוב עם פורמלדהיד. השימוש glutaraldehyde יש כמה חסרונות שיש לקחת בחשבון כפי שהוא מציג כמה קבוצות אלדהיד חינם לתוך הרקמה הקבועה, אשר עשוי ליצור כמה תיוג לא ספציפי. גם ההצלבה בין חלבונים ומולקולות אחרות מדי פעם עלולה להפוך כמה אפיטופים היעד נגיש עבור הנוגדנים. כדי להימנע מכך, יש להגדיר בזהירות את הכמות ומשך הקיבעון.
לאחר הקיבעון, הדוגמאות מוטבעות בשוחלת המתאימה כדי להקשיח לפני קבלת המקטעים. שרף לונדון (LR-לבן) שרף אקרילי הוא השרף של בחירה עבור מחקרים immunolocalization. שלא כמו שרפים אחרים, LR-White הוא הידרופילי, המאפשר לנוגדנים להגיע לאנטיגנים שלהם, ללא צורך בטיפול כלשהו כדי להקל עליו. LR-White יש גם את היתרון של הצעת פלואורסצנטיות אוטומטית נמוכה, המאפשר ירידה ברעש רקע במהלך הדמיה immunofluorescence.
ישנן טכניקות כתמים רבות הזמינות לגילוי רכיבים שונים של דופן התא, כגון כתמים כחולים אלסיאניים, כתמי כחול טולואידין או כתמי חומצה תקופתית-שיף (PAS). אף אחד מאלה אינו מציע את הכוח של ניתוחי אימונולוקליזציה8. גישה זו מעניקה ספציפיות רבה יותר בזיהוי הגליקנים, ומציעה מידע נרחב יותר לגבי הרכב ומבנה דופן התא.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת האימונולוקליזציה הפלואורסצנטית בצמחים כאן תיארה, אף שהיא פשוטה בצורה חלקה, מסתמכת על ההצלחה של מספר צעדים קטנים. הראשון שבהם הוא הכנה וקיבעון לדוגמה. במהלך צעד ראשון זה, תערובת של פורמלדהיד ו glutaraldehyde משמש כדי crosslink רוב מרכיבי התא. הפורמלדהיד בתמיסה מספק קיבעון קל וניתן הפיכה בעוד הגלו…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים קיבלו תמיכה מפרויקט האיחוד האירופי 690946 ‘SexSeed’ (רבייה של צמחים מיניים – היווצרות זרעים) במימון H2020-MSCA-RISE-2015 ו- SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP קיבלה מענק מפרויקט MSCA-IF-2016 של האיחוד האירופי (מס’ 753328). MC קיבלה מענק ממענק FCT PhD SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Ethanol absolute | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| vaccum chamber | na | na | |
| vaccum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
Referencias
- Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
