Fluoreszierende Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen in der Zellwand von Pflanzengeweben
Summary
Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie das Pflanzenmaterial für die Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen fixiert, in ein hydrophiles Acrylharz eingebettet, geschnitten und auf Glasrutschen montiert ist. Wir zeigen, dass zellwandbezogene Epitope mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden.
Abstract
Die Pflanzenentwicklung beinhaltet ständige Anpassungen der Zellwandzusammensetzung und -struktur als Reaktion auf innere und äußere Reize. Zellwände bestehen aus Zellulose und nicht-zellulosehaltigen Polysacchariden zusammen mit Proteinen, Phenolverbindungen und Wasser. 90% der Zellwand besteht aus Polysacchariden (z.B. Pektine) und Arabinogalactan-Proteinen (AGPs). Die fluoreszierende Immunlokalisierung spezifischer Glykanepitope in pflanzenhistologischen Abschnitten bleibt ein Schlüsselwerkzeug, um die Umgestaltung von Wandpolysaccharidnetzwerken, -strukturen und -komponenten aufzudecken.
Hier berichten wir über ein optimiertes fluoreszierendes Immunlokalisierungsverfahren zum Nachweis von Glykanepitopen aus AGPs und Pektinen in Pflanzengeweben. Paraformaldehyd/Glutaraldehyd-Fixierung wurde zusammen mit DER LR-White Einbettung der Pflanzenproben verwendet, was eine bessere Erhaltung der Gewebestruktur und -zusammensetzung ermöglicht. Dünne Abschnitte der mit einem Ultramikrotom erhaltenen eingebetteten Proben wurden zur Immunlokalisierung mit spezifischen Antikörpern verwendet. Diese Technik bietet eine großartige Auflösung, hohe Spezifität und die Möglichkeit, mehrere glykanische Epitope in der gleichen Probe zu erkennen. Diese Technik ermöglicht die subzelluläre Lokalisierung von Glykanen und erkennt deren Akkumulation in der Zellwand. Es ermöglicht auch die Bestimmung von räumlich-zeitlichen Mustern der AGP- und Pektinverteilung während entwicklungsischer Prozesse. Die Verwendung dieses Werkzeugs kann letztlich Forschungsrichtungen leiten und Glykane mit bestimmten Funktionen in Pflanzen verknüpfen. Darüber hinaus können die erhaltenen Informationen biochemische und Genexpressionsstudien ergänzen.
Introduction
Pflanzenzellwände sind komplexe Strukturen, die aus Polysacchariden und Glykoproteinen bestehen. Zellwände sind extrem dynamische Strukturen, deren Architektur, Organisation und Zusammensetzung je nach Zelltyp, Lokalisierung, Entwicklungsstadium, äußeren und inneren Reizen variieren1. Arabinogalactan Proteine (AGPs) und Pektine sind wichtige Bestandteile der Pflanzenzellwand. AGPs sind hochglykosylierte Proteine und Pektine sind homogalacturonanpolysaccharide, deren Zusammensetzung, Menge und Struktur in verschiedenen Pflanzenentwicklungsstadien stark variieren2,3,4. AGPs und Pektinstudien haben ihre Beteiligung an mehreren Pflanzenprozessen wie programmiertem Zelltod, Reaktion auf abiotische Belastungen, sexuelle Pflanzenreproduktion, unter vielen anderen5gezeigt. Die meisten dieser Studien begannen mit Informationen aus Immunlokalisierungsstudien.
Angesichts seiner Komplexität erfordert das Studium von Zellwänden viele verschiedene Werkzeuge. Der Nachweis von Glykinepitopen mit monoklonalen Antikörpern (mAbs) ist ein wertvoller Ansatz, um die Verteilung von Polysaccharid und Glykoprotein entlang dieser Struktur aufzulösen. Es gibt eine große Sammlung von mAbs zur Verfügung, um Glyglyan-Epitope zu erkennen und die Spezifität jedes mAb wird kontinuierlich verbessert sowie6. Die hier beschriebene Technik ist auf alle Pflanzenarten anwendbar und ist ein perfektes Werkzeug, um zukünftige Forschungsrichtungen zu leiten, die teurere und komplexere Techniken beinhalten könnten.
Bei dieser Technik werden spezifische Antikörper chemisch mit fluoreszierenden Farbstoffen wie FITC (Fluorescein isothiocyanat), TRITC (Tetramethylrhodamine-5-(und 6)-isothiocyanat) oder mehreren Alexa-Fluorfarbstoffen konjugiert. Die Immunfluoreszenz bietet mehrere Vorteile, die eine klare und schnelle subzelluläre Lokalisation von Glykanen ermöglichen, die direkt unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden können. Es ist sehr spezifisch und empfindlich, da die Herstellung der Probe effektiv die natürliche Struktur des Antigens schützen kann, auch wenn es in geringeren Mengen vorhanden ist. Es ermöglicht die Detektion von mehreren Antigenen in der gleichen Probe und am wichtigsten, bietet hohe Qualität und visuell schöne Ergebnisse. Trotz der großen Macht, die Fluoreszenz-Immunlokalisierungsstudien bieten, werden sie oft als schwierig durchzuführen und umzusetzen angesehen, höchstwahrscheinlich aufgrund des Fehlens detaillierter Protokolle, die die Visualisierung der verschiedenen Schritte des Verfahrens ermöglichen. Hier bieten wir einige einfache Richtlinien, wie diese Technik durchgeführt werden und wie man qualitativ hochwertige Bilder erhält.
Für das hier vorgestellte Protokoll müssen Die Proben zunächst mit dem am besten geeigneten Fixierungsprotokoll fixiert und eingebettet werden. Obwohl als zeitaufwändige und relativ mühsame Technik betrachtet, ist die richtige Fixierung und Einbettung der Pflanzenprobe der Schlüssel, um einen erfolgreichen Immunlokalisierungstest zu gewährleisten. Zu diesem Zweck ist die üblichste chemische Fixierung mit vernetzungsfixativen, wie Aldehyden. Vernetzungsfixative stellen chemische Bindungen zwischen Gewebemolekülen her, stabilisieren und verhärten die Probe. Formaldehyd und Glutaraldehyd sind vernetzungsfixative, und manchmal wird eine Mischung aus beiden Fixativen verwendet7. Formaldehyd bietet eine große strukturelle Konservierung von Geweben und über einen längeren Zeitraum, produziert kleine Geweberückzüge und ist mit der Immunfärbung kompatibel. Glutaraldehyd ist ein stärkeres und stabiles Fixativ, das in der Regel in Kombination mit Formaldehyd verwendet wird. Die Verwendung von Glutaraldehyd hat einige Nachteile, die berücksichtigt werden müssen, da es einige freie Aldehydgruppen in das feste Gewebe einführt, was zu einer unspezifischen Kennzeichnung führen kann. Auch die Vernetzung zwischen Proteinen und anderen Molekülen kann gelegentlich dazu führen, dass einige Zielepitope für die Antikörper unzugänglich werden. Um dies zu vermeiden, müssen Menge und Dauer der Fixierung sorgfältig definiert werden.
Nach der Fixierung werden die Proben in das richtige Harz eingebettet, um vor dem Erhalt der Abschnitte zu härten. London Resin (LR-White) Acrylharz ist das Harz der Wahl für Immunlokalisierungsstudien. Im Gegensatz zu anderen Harzen ist LR-White hydrophil, so dass die Antikörper ihre Antigene erreichen können, ohne dass eine Behandlung erforderlich ist, um es zu erleichtern. LR-White hat auch den Vorteil, eine geringe Autofluoreszenz zu bieten, was eine Reduzierung von Hintergrundgeräuschen während der Immunfluoreszenz-Bildgebung ermöglicht.
Es gibt viele Färbetechniken zur Verfügung, um verschiedene Komponenten der Zellwand zu erkennen, wie Alcian blaue Färbung, Toluidin blau Färbung oder Periodische Säure-Schiff (PAS) Färbung. Keines davon bietet die Kraft der Immunlokalisierungsanalysen8. Dieser Ansatz gibt eine größere Spezifität bei der Detektion von Glykanen und bietet umfangreichere Informationen über die Zusammensetzung und Struktur der Zellwand.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene fluoreszierende Immunlokalisierungsmethode in Pflanzen, die zwar nahtlos unkompliziert ist, beruht jedoch auf dem Erfolg mehrerer kleiner Schritte. Die erste davon ist die Probenvorbereitung und -fixierung. In diesem ersten Schritt wird ein Gemisch aus Formaldehyd und Glutaraldehyd verwendet, um die Mehrheit der Zellkomponenten zu vernetzen. Das Formaldehyd in der Lösung sorgt für eine milde und reversible Fixierung, während das Glutaraldehyd eine starke dauerhaftere Verbindung bietet; das Gleich…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützung erhielten die Autoren aus dem EU-Projekt 690946 “SexSeed” (Sexuelle Pflanzenreproduktion – Saatgutbildung), das von H2020-MSCA-RISE-2015 und SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017 gefördert wird. AMP erhielt ein Stipendium aus dem Projekt MSCA-IF-2016 der Europäischen Union (Nr. 753328). MC erhielt ein Stipendium aus dem FCT PhD-Stipendium SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Ethanol absolute | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| vaccum chamber | na | na | |
| vaccum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
Referencias
- Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
