Semi-Minimal invasiv metod för att inducera hjärtinfarkt hos råttor och bedömning av hjärtfunktionen av en isolerad working heart system

Det experimentella protokoll som gav de resultat som beskrivs i denna artikel har godkänts av den regionala etikkommittén för laboratoriedjurförsök vid Medicinska universitetet i Wien och det österrikiska förbundsministeriet för utbildning, vetenskap och forskning (BMWFW-66.009/0023-WF/V/3b/2016). Alla experiment överensstämmer med handledningen för vård och användning av försöksdjur, publicerad av US National Institutes of Health (NIH Publikation nr 85-23, reviderad 1996). OBS: 10−12 veckor gamla hanar Sprague Dawley råttor på 250−300 g kroppsvikt (BW) används. Eftersom följande procedurer och behandlingar utförs i en steril miljö i ett operationsrum (OR), använd scrubs, handskar, ansiktsmasker och huvor vid hantering av djur. Innan du går in i OPERATIONS, se till att händerna tvättas och desinficeras. Om avsikten är att verka på flera djur i en kirurgisk session, antingen tvätta och desinficera, eller autoklav instrumenten mellan operationer. Dessa hygieniska riktlinjer gäller för alla förfaranden som presenteras i protokollavsnittet. 1. Preoperativ förberedelse och anestesi Initiera preoperativ anestesi genom att injicera en blandning av xyazin (4 mg/kg BW) och ketamin (100 mg/kg BW) intraperitonealt. Intubera råttorna med ett 14 G-rör och volymstyrd ventilation med en blandning av O2, luft och isofluran (1−2,5%) vid 75−85 slag/min, 100 ml/stroke/BW (figur 1A). Om det behövs, för en bättre bild medan intubating: applicera Xylocain via en bomullsullsspets på nedre svalget för att uppnå lokal avkoppling. Placera råttorna på ett uppvärmt manöverbord i ryggläge och fäst frambenen med tejp (bild 1B). Mät rektaltemperaturen med en sond.OBS: Den bör bibehållas mellan 37,5−38,5 °C. Raka bröstkorgen och rengör operationsområdet med antiseptisk povidone jodlösning. Applicera ögonsalven på råttan för att förhindra torkning av ögonen. Administrera intraoperativ analgesi genom att injicera piritramid (0,1 ml/kg BW) intraperitonealt. Placera EKG-sonder subkutant i djurets extremiteter. Kontrollera svans och tå reflexer innan påbörja det kirurgiska ingreppet. 2. Kirurgiskt ingrepp—induktion av hjärtinfarkt Utför hudsnitt med hjälp av en skalpell. Se till att starta 2 mm parasternal på vänster bröstkorg i nivå med den 3: e interkostala utrymmet och fortsätta till den främre axillary linjen på nivån för den 5: e interkostala utrymmet (Figur 1C). Byt ut de ytliga musklerna försiktigt för att göra revbenen synliga (figur 1D). Vid mindre blödning, använd en cauter för att utplåna eller koppla bort den omgivande vävnaden. Utför bröstkoktoatomin i nivå med det 4:e interkostala utrymmet och sätt i ett upprullningsdon för att få synbarhet av hjärtat och lungan (figur 1E). Öppna försiktigt lungsäcken för att undvika blödning. Tillfälligt ockludera LAD med hjälp av en tourniquet att inducera ischemi / reperfusion (MIR) under en definierad tid; eller permanent (MI) ocklude det genom att göra 6−7 knop med hjälp av en 6-0 sutur för att stänga ligering (Figur 1F,G).OBS: Den högra platsen för lad-ocklusion ligger ca 2−3 mm under den vänstra öronen på hjärtats ventrala/vänstra laterala marginal. Lyckad ocklusion är associerad med EKG-förändringar (ST-segmentet höjd) och makroskopiska förändringar i LV som paling. När det gäller ischemi/reperfusion-modellen, öppna LAD:n igen genom att ta bort tourniquet efter 30 minuters ocklusion. Stäng bröstkorgen med tre enknapps suturer med hjälp av en 4-0 enda monofilament sutur (figur 1H). Innan den sista suturen dras åt, ta bort eventuell kvarvarande luft från bröstkorgen med en 10 ml spruta för att förhindra en lungkollaps (figur 1I). Flytta musklerna och stäng av flyktig anestesi. Sutur huden med en kontinuerlig sutur med hjälp av en 4-0 sutur (figur 1J). Administrera en antiseptisk spray för att skydda mot infektioner och bita av suturen av råttor. 3. Kriterier för postoperativ behandling och uteslutning Håll råttorna på värmebordet tills de vaknar. Extubera råttorna så snart de börjar andas spontant. Lägg de extubated råttorna i en bur under en värmelampa för att förhindra att de kyls. Återför råttor till djurstallatet under standardiserade förhållanden när de börjar bete sig normalt igen. Tillsätt 2 ampuller piritramid och 30 ml 5% glukos till 250 ml vatten för postoperativ analgesi i tre dagar. Kontrollera råttornas lämplighet och beteende med checklista- och uteslutningskriterierna (tabell 1). Observera djuren två gånger om dagen under följande vecka, sedan två gånger i veckan.ANMÄRKNING: I enlighet med internationella normer, presentera eventuella lidande djur, eller djur som får upp till 6 poäng i utvärderingen med checklistan, till veterinärer att fatta terapi-relaterade beslut. Alla djur som får 7 eller fler poäng måste omedelbart offras med en överdos av ketamin och xyazin. Undersökning Observation Poäng Kroppsvikt Stabil 0 10% förlust 4 15% förlust för 48 h 7 18% förlust 7 normal (päls platt och glänsande) 0 Yttre utseende piloerection (piloerection) 1 hematom 2 hudsår/skärsår/bitmärken 2 kraftigt minskad grooming 4 (öppningar orena/koagulerade eller fuktiga) 7 allvarliga hudirritationer eller sår 7 böjd hållning >2 h 7 betydande bukdistension (ascites) 7 Beteende normal (sovande, nyfiken, sociala kontakter, reaktion vid beröring) 0 ovanligt beteende, t.ex. 2 självisolering, uttalad hyperaktivitet eller stereotypi 4 letargi för <6 h 4 letargi för 6 h till 8 h 7 apati >8 h 7 stereotypi oavbrutet i >10 min. och kvarstår fortfarande efter 2 h 7 tecken på smärta vid beröring 7 automutilation 7 Matsmältningen Normal 0 diarré (mjuk avföring) 3 diarré för 72 h eller vattniga 7 blodig avföring 7 Tabell 1: Checklista och uteslutningskriterier. Denna tabell innehåller de undersökningar som måste observeras och motsvarande poäng. Därför måste den postoperativa behandlingen av djuret anpassas, eller så måste en veterinär rådfrågas. 4. Ekokardiografimätningar OBS: Ekokardiografi utförs vanligtvis två gånger, före induktion av hjärtinfarkt och innan organen skördas. Injicera råttor med en blandning av xyazin (4 mg/kg BW) och ketamin (100 mg/kg BW) intraperitonealt. Placera råttorna i ryggläge på en värmebricka. Applicera ekogel på bröstet, vilket hjälper ultraljudsvågorna att färdas bättre och minskar signalstörningar. Få parasternal kort axel vyer av LV hålighet på nivån för papillärmuskeln. Utför M-läge ekokardiografi för att mäta vänster Ventrikulärt utkast fraktion och morfologi. 5. Organskörd (utan att arbeta hjärta) Administrera xyazin (4 mg/kg BW) och ketamin (100 mg/kg BW) intraperitonealt före organskörd. Se till att reflexerna är negativa.OBS: Ingen intubation krävs eftersom proceduren inte varar längre än 1 min. Använd en skalpell för att göra ett hudsnitt under xiphoid och utvidga den parallellt till revbenen på båda sidor med sax. Skär revbenen i den främre armhålan linjen och ta tag i xiphoid att lyfta bröstet upp(Figur 2A). Ta bort anatomiska eller fibrotiska vävnadssamvidhäftningar genom att försiktigt rupturera vävnaden med två par pincett. Ta blodprover (för blodgasutvärdering eller molekylära analyser) från vena cava sämre med en 5 ml spruta. Utför excision av hela hjärtat vid inlopps- och utloppsnivån (figur 2B). Fortsätt vid behov med att utvärdera arbetshjärtat enligt beskrivningen i avsnitt 6. Skördeorgan, chockfrost dem i flytande kväve och förvara i -80 °C för ytterligare molekylära analyser, eller i formaldehyd för histologiska ändamål. 6. Ex vivo hemodynamic mätningar via ett fungerande hjärtsystem OBS: Apparatens allmänna inställning och komponenter har beskrivits tidigare11. Följande protokoll beskriver hanteringen av djurets hjärta och de nödvändiga stegen för att utvärdera LV-funktionen. Söva råttor som beskrivs i steg 5.1 och injicera 200 IE av heparin intravenöst (femorala venen). Öppna bröstkorgen via ett snitt under costalbågen med en skalpell och sträck ut den till både främre armhålorna med sax och lyft bröstbenet. Skär de stora fartygen nära deras utlopp eller inlopp till hjärtat för att punktskatta det (figur 2B). Fördjupa hjärtat i iskall Krebs-Henseleit buffert och montera den på erytrocyt-perfunderas isolerade hjärtat systemet via kanylformning av aorta (Figur 3A). Börja med LD-läget med en konstant efterlast på 60 mmHg (stabiliseringsperiod). Efter 15 minuter LD-läge växlar du till WH-läget. Kannulera därför det vänstra atriumet via en lung ven (figur 3B). Ändra sedan flödesriktningen i systemet genom att öppna klippet som ocklurar förmakskanylen. Detta resulterar i en perfusion av det vänstra atriumet och ett fysiologiskt blodflöde i det vänstra hjärtat11. Registrera hemoodynamiska mätningar för 20 min i WH-läget. Samla bloddroppar av koronar med en 2 ml spruta för att mäta koronarflöde (CF, mL/min) var 5:e minut.OBS: CF mäts som skillnaden mellan vänster förmaksflöde (LAF) och aortaflöde (AF). Utför kontinuerliga mätningar av LAF (motsvarande hjärtminutvolym) och AF med en flödessond.OBS: Sonden sätts in via WH-apparaten i LV. Alla uppgifter registreras kontinuerligt. Om det pågående protokollet begär, sätt in en high-fidelity kateter retrograd via aortaklaffen i LV och mäta vänster ventrikel systoliskt tryck (LVSP). För att bedöma det tryckvolymsarbete som utförs per minut, beräkna slagvolymen som hjärtminutvolym dividerat med hjärtfrekvens. Beräkna externt hjärtarbete (EHW) enligt följande formel: CO x LVSP (g x m/min) normaliserat till hjärtvikt.