Detección de fitoestrógenos usando un ensayo de receptores de estrógeno a base de células β Reporter
Summary
Hemos optimizado un receptor de estrógeno disponible comercialmente β ensayo reportero para la detección de alimentos de primates humanos y no humanos para la actividad estrogénica. Validamos este ensayo al mostrar que el alimento humano estrogénico conocido de soja de alimentos humanos registra altos, mientras que otros alimentos no muestran actividad.
Abstract
Las plantas son una fuente de alimento para muchos animales, y pueden producir miles de productos químicos. Algunos de estos compuestos afectan los procesos fisiológicos en los vertebrados que los consumen, como la función endocrina. Fitoestrógenos, los fitoquímicos endocrinos activos más bien estudiados, interactúan directamente con el eje gonadal hipotálamo-pituitario del sistema endocrino vertebrado. Aquí presentamos el novedoso uso de un ensayo basado en células para examinar extractos vegetales para detectar la presencia de compuestos que tienen actividad biológica estrogénica. Este ensayo utiliza células de mamíferos diseñadas para expresar altamente el receptor de estrógeno beta (ERβ) y que han sido transfectadas con un gen luciferasa. La exposición a compuestos con actividad estrogénica da como resultado que las células produzcan luz. Este ensayo es una forma fiable y sencilla de probar la actividad estrogénica biológica. Tiene varias mejoras sobre los ensayos transitorios de transfección, sobre todo, la facilidad de uso, la estabilidad de las células y la sensibilidad del ensayo.
Introduction
Las plantas son una fuente necesaria de alimento para muchos animales, proporcionando calorías y nutrientes críticos para la supervivencia, reproducción, crecimiento, desarrollo y comportamiento1. Las plantas producen miles de productos químicos, muchos como adaptaciones para su propio crecimiento, mantenimiento estomático y reproducción. Otros compuestos, considerados metabolitos secundarios vegetales (PSM), tienen funciones menos claras, aunque algunos son tóxicos y probablemente utilizados como defensa contra herbívoros y parasitismo (por ejemplo, alcaloides, taninos)2,3. Algunos de estos productos químicos tienen la capacidad de afectar los procesos fisiológicos a largo plazo en animales, como el funcionamiento endocrino, aunque por qué estos fitoquímicos endocrino-activos interactúan con el sistema endocrino vertebrado todavía no está claro2,4.
Los fitoestrógenos, los fitoquímicos endocrinos activos más estudiados, son PSM polifenólicos que imitan estructural y funcionalmente los estrógenos, interactuando directamente con el eje gonadal hipotalo-pituitario del sistema endocrino vertebrado5. La ingestión de fitoestrógenos en la dieta humana se asocia con la protección contra algunos tipos de cáncer, enfermedades cardíacas y síntomas menopáusicos, aunque otros efectos incluyen problemas de fertilidad. De hecho, los efectos fisiológicos de estos compuestos fueron descubiertos en la década de 1940 cuando la infertilidad en ovejas se atribuyó a su pastoreo en trébol rico en fitoestrógenos (Trifolium subterrareum)6. Cuando se ingiere, fitoestrógenos pueden pasar a las células e imitar los efectos del estrógeno. Mientras que los fitoestrógenos tuvieron efectos negativos sobre la fertilidad de las ovejas, la relación entre fitoestrógenos y fisiología no es simple. Al igual que las ovejas, los rinocerontes blancos del sur muestran sensibilidad a los compuestos estrogénicos en piensos derivados de grandes cantidades de soja y alfalfa. Las hijas de mujeres alimentadas con esta dieta durante el embarazo tienen menos probabilidades dereproducirse 7. Sin embargo, otros estudios han demostrado que los fitoestrógenos también pueden tener efectos positivos, incluyendo la maduración de folículos ováricos en ratones mayores8,prevención de ciertos tipos de cáncer, actividad antioxidante, y efectos antiproliferativos9.
La amplitud de los efectos de los fitoestrógenos no es sorprendente dado que los estrógenos afectan a una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo el crecimiento, el desarrollo y la regulación de los sistemas nerviosos reproductivos y centrales10. Aunque hay muchos mecanismos de acción, fitoestrógenos a menudo tienen la capacidad de modificar, mejorar, o interrumpir la señalización de estrógeno a través de su capacidad para actuar como ligandos para los receptores de estrógeno intranuclear alfa y beta (ERα y ERβ). Muchos fitoestrógenos tienen una estructura de anillo fenólico similar a los estrógenos que les permite unir receptores de estrógeno. Aquellos con actividad estrogénica agonística funcionan como estrógeno, formando un complejo activado de ligando ER que puede dimerizar y unirse a un elemento de respuesta de estrógeno (ERE) y desencadenar la transcripción del gen11. Por lo tanto, estrógenos y fitoestrógenos regulan la actividad celular y las funciones del sistema a través de sus acciones como factores de transcripción.
Aquí presentamos el novedoso uso de un ensayo basado en células para examinar extractos vegetales para detectar la presencia de compuestos que tienen actividad biológica estrogénica. Este ensayo utiliza células CHO de ovario de hámster chino diseñadas para expresar altamente ERβ, que han sido transfectadas con el gen luciferasa firefly(Photinus pyralis)vinculado a un promotor de ERE12. Cuando hay compuestos estrogénicos, se unen a urgencias, dimerizan y se unen al ERE, lo que lleva a la transcripción del gen luciferasa. Tras la adición de una solución de sustrato, la luciferasa cataliza una reacción que conduce a la emisión de fotones. Por lo tanto, las muestras positivas producen muestras ligeras y negativas.
Este ensayo disponible comercialmente elimina la necesidad de laboratorios para transfectar las células de mamíferos con el gen reportero y el receptor de estrógeno13,14, que era inestable y variable en eficacia. El ensayo proporciona una plataforma de transfección estable que permite determinar rápida y simplemente si una planta tiene actividad estrogénica a través de la unión de receptores.
Probamos la hipótesis de que la soja tiene mayor actividad estrogénica que todos los demás alimentos dadas sus concentraciones conocidas de isoflavonas estrogénicas15 utilizando alimentos humanos de supermercados locales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de reportero ERβ desarrollado para examinar individualmente agentes farmacéuticos también es adecuado para la detección de alimentos vegetales para fitoestrógenos biológicamente activos a través del ERβ. Las consideraciones importantes en el protocolo incluyen el tratamiento de las muestras vegetales con cuidado: el material vegetal fresco debe secarse rápidamente para evitar el moldeo u otra degradación biológica, y debe mantenerse alejado de la luz para evitar la fotolisis de los compuestos<sup cla…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están agradecidos a Dale Leitman por el entrenamiento inicial en el uso de ensayos transitorios de transfección para determinar la actividad estrogénica de los alimentos vegetales primates. Gracias a Bradford Westrich y C. Eric Johnson por ayudar a establecer equipos de laboratorio y capacitar a los estudiantes en métodos de extracción. Por último, gracias a la Universidad de Indiana por financiar esta investigación.
Materials
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ℃ water bath | |||
| 37 ℃, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
Referencias
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