Summary

Retinale vasculaire reactiviteit zoals beoordeeld door optische coherentie tomografie Angiografie

Published: March 26, 2020
doi:

Summary

Dit artikel beschrijft een methode voor het meten van retinale vasculatuur reactiviteit in vivo met menselijke proefpersonen met behulp van een gas ademhaling provocatie techniek om vasoactieve stimuli te leveren tijdens het verwerven van retinale beelden.

Abstract

De vasculaire toevoer naar het netvlies is aangetoond dat dynamisch aan te passen door middel van vasoconstrictie en vasodilatatie aan de metabole eisen van het netvlies tegemoet te komen. Dit proces, aangeduid als retinale vasculaire reactiviteit (RVR), wordt bemiddeld door neurovasculaire koppeling, die zeer vroeg wordt aangetast in retinale vasculaire ziekten zoals diabetische retinopathie. Daarom kan een klinisch haalbare methode voor het beoordelen van vasculaire functie van groot belang zijn voor zowel onderzoek als klinische instellingen. Onlangs is in vivo beeldvorming van de retinale vasculatuur op capillair niveau mogelijk gemaakt door de FDA-goedkeuring van optische coherentie tomografieangiografie (OCTA), een niet-invasieve, minimale risico- en kleurstofloze angiografiemethode met capillaire niveauresolutie. Tegelijkertijd zijn fysiologische en pathologische veranderingen in RVR aangetoond door verschillende onderzoekers. De methode in dit manuscript is ontworpen om RVR te onderzoeken met behulp van OCTA zonder dat wijzigingen aan de klinische beeldvormingsprocedures of het apparaat nodig zijn. Het toont real-time beeldvorming van het netvlies en retinale vasculatuur tijdens blootstelling aan hypercapische of hyperoxische aandoeningen. Het examen is gemakkelijk uit te voeren met twee medewerkers in minder dan 30 min met een minimaal onderwerp ongemak of risico. Deze methode is aanpasbaar aan andere oogheelkundige beeldvormingsapparaten en de toepassingen kunnen variëren op basis van de samenstelling van het gasmengsel en de patiëntenpopulatie. Een kracht van deze methode is dat het mogelijk maakt voor een onderzoek van retinale vasculaire functie op het capillaire niveau bij menselijke proefpersonen in vivo. Beperkingen van deze methode zijn grotendeels die van OCTA en andere retinale imaging methoden met inbegrip van beeldvorming artefacten en een beperkt dynamisch bereik. De resultaten verkregen uit de methode zijn OCT en OCTA beelden van het netvlies. Deze beelden zijn vatbaar voor elke analyse die mogelijk is op commercieel beschikbare OCT- of OCTA-apparaten. De algemene methode kan echter worden aangepast aan elke vorm van oogheelkundige beeldvorming.

Introduction

De metabolische vraag van het netvlies is afhankelijk van een adequate en constante toevoer van zuurstof door een goed gereguleerd systeem van arterioles, haarvaten en venules1. Verschillende studies hebben aangetoond dat de functie van groter kaliber menselijke netvliesvaten in vivo kan worden beoordeeld met verschillende fysiologische2,,3,,4,5 en farmacologische6,7 stimuli. Bovendien, abnormale functie van dit vasculaire systeem komt vaak voor bij retinale vasculaire ziekten zoals diabetische retinopathie waar retinale vasculaire reactiviteit (RVR) is aangetoond te worden verzwakt, zelfs in de vroegste stadia8,9 door zowel gas provocatie9 en flikkerende licht experimenten5,10,11. Retinale vasculaire risicofactoren zoals roken zijn ook gecorreleerd met verminderde RVR12 en retinale bloedstroom13. Deze bevindingen zijn belangrijk omdat de klinische symptomen van retinale vasculaire aandoeningen relatief laat in het ziekteproces optreden en bewezen vroege klinische markers van de ziekte ontbreken14. Zo kan het beoordelen van RVR nuttige maatregelen van vasculaire integriteit bieden voor de vroege beoordeling van afwijkingen die netvliesdegeneratieve ziekten kunnen initiëren of verergeren.

Eerdere RVR experimenten hebben meestal vertrouwd op apparaten zoals een laser bloedstroomteller9 of fundus camera’s uitgerust met speciale filters15 voor retinale beeld verwerving. Echter, deze technologieën zijn geoptimaliseerd voor grotere diameter vaten zoals arterioles16 en venules15, die niet waar gas, micronutriënten en moleculaire uitwisseling optreden. Een meer recente studie was in staat om de RVR van haarvaten te kwantificeren met behulp van adaptieve optische beeldvorming17, maar ondanks de verbeterde ruimtelijke resolutie, deze beelden hebben een kleinere veldgrootte en zijn niet FDA goedgekeurd voor klinisch gebruik18.

De recente komst van optische coherentie tomografie angiografie (OCTA) heeft een FDA goedgekeurde, niet-invasieve en kleurstofloze angiografische methode voor de beoordeling van capillaire niveau veranderingen bij menselijke patiënten en proefpersonen in vivo. OCTA wordt algemeen aanvaard in de klinische praktijk als een effectief instrument voor de beoordeling van bijzondere waardevermindering in capillaire perfusie in retinale vasculaire ziekten zoals diabetische retinopathie19, retinale veneuze occlusies20, vasculitis21 en vele anderen22. OCTA biedt daarom een uitstekende gelegenheid voor de evaluatie van capillaire niveauveranderingen, die significante ruimtelijke en temporele heterogeniteit23 evenals pathologische veranderingen kunnen hebben, in een klinische omgeving. Onze groep heeft onlangs aangetoond dat OCTA kan worden gebruikt om de responsiviteit van retinale vaten op capillair niveau2 te kwantificeren tot fysiologische veranderingen in geïnspireerde zuurstof, dat is een retinale vasoconstrictieve stimulus16,24, en kooldioxide, dat is een retinale vaatverwijdende stimulus3,5.

Het doel van dit artikel is om een protocol te beschrijven waarmee de lezer de retinale vasculaire reactiviteit van de kleinere arterioles en capillaire bed met octa kan beoordelen. De methoden zijn aangepast aan die in Lu et al.25 die de meting van cerebrovasculaire reactiviteit met magnetische resonantie beeldvorming beschreven. Hoewel de huidige methoden werden ontwikkeld en gebruikt tijdens OCTA imaging2,zijn ze van toepassing op andere retinale beeldvormingsapparaten met relatief eenvoudige en voor de hand liggende wijzigingen.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de University of Southern California Institutional Review Board en hield zich aan de principes van de Verklaring van Helsinki. 1. Installatie van gasniet-ademende apparatuur Figuur 1: Diagram van het niet-herademende apparaat. De volledige opstelling is opgesplitst in drie afzonderlijke eenheden op ba…

Representative Results

De output van dit experiment bestaat uit de handmatige metingen van de pulsoximeter, de timing die wordt vermeld voor blootstelling aan gas of OCTA-scanning en de ruwe OCTA-beeldvormingsgegevens. Een OCTA-afbeelding bestaat uit de OCT B-scans en het decorrelatiesignaal dat bij elke B-scan is gekoppeld. De gegevensparameters worden gegeven door de specificaties van het apparaat. Een geveegde bron laserplatform OCTA machine met een centrale golflengte van 1040-1060 nm werd gebruikt. De beelden bieden een transversale resol…

Discussion

De zojuist beschreven methode is het volledige protocol voor een provocatieexperiment voor gasademhaling dat het mogelijk maakt om de RVR van een onderwerp in een gecontroleerde omgeving te meten op specifieke tijdpunten zonder wijzigingen aan het OCTA-beeldvormingsapparaat en een minimaal ongemak of risico voor het onderwerp. Deze setup wordt beschreven op een manier die het mogelijk maakt voor eenvoudige wijzigingen aan de behoeften van de onderzoeker te passen. Het is geschikt voor extra buizen om verschillende klinie…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door NIH K08EY027006, R01EY030564, UH3NS100614, Research Grants van Carl Zeiss Meditec Inc (Dublin, CA) en Unrestricted Department Funding from Research to Prevent Blindness (New York, NY).

Materials

5% CO2 gas [5% CO2, 21% O2, 74% N2] (Compressed) Institution Dependent (Praxair)
Bacdown Disinfectant Detergent Decon Labs 8001 https://deconlabs.com/products/disinfectant-bdd/
Clean-Bor Tubes (35 mm Inner Diameter) Vacumed 1011-108 http://www.vacumed.com/zcom/product/Product.do?compid=27&skuid=1197
Cuff adapter for Douglas bag filling Vacumed 22254 http://www.vacumed.com/zcom/product/Product.do?compid=27&prodid=343
Douglas bag (200-liter capacity) Harvard Apparatus 500942 https://www.harvardapparatus.com/douglas-bag.html
Elbow Joint (Inner Diameter 19mm/ Outer Diameter 22 mm), Modified in House
Fingertip Pulse Oximeter (Pro-Series) CMS CMS 500DL https://www.walmart.com/ip/Pro-Series-CMS-500DL-Fingertip-Pulse-Oximeter-Blood-Oxygen-Saturation-Monitor-with-silicon-cover-batteries-and-lanyard/479049154
Gas Delivery Tube (22 mm Inner Diameter) Modified in House
Gas filling tube (1/8" for compressed gas)
Hydrogen Peroxide Cleaner Disinfectant Wipes Clorox Healthcare 30824 https://www.cloroxpro.com/products/clorox-healthcare/hydrogen-peroxide-cleaner-disinfectants/?gclid=EAIaIQobChMIk-KG4vi15QIVcRh9Ch0NNwLPEAAYASAAEgJIa_D_BwE&gclsrc=aw.ds
Lubricant Eye Drops Refresh Refresh Plus https://www.refreshbrand.com/Products/refresh-plus
Manual Directional Control Valves: Three-Way T-Shape Stopcock Type (Inner Diameter 28.6 mm, Outer Diameter 35 mm) Hans Rudolph 2100C Series www.rudolphkc.com
Medical O2 (Compressed) Institution Dependent
Mouth piece (Silicone, Model #9061) Hans Rudolph 602076 www.rudolphkc.com
OCTA Imaging Device (PLEX Elite 9000) Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA https://www.zeiss.com/meditec/int/product-portfolio/optical-coherence-tomography-devices/plex-elite-9000-swept-source-oct.html
Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2.5% Paragon Bioteck, Inc NDC 42702-102-15 https://paragonbioteck.com/products/diagnostics/phenylephrine-hydrochloride-ophthalmic-solution-usp-2-5/
Plastic Nose Clip Sterile Foam CS100 Sklar Sterile 96-2951 https://www.sklarcorp.com/disposables/plastic/plastic-nose-clip-sterile-foam-box-of-100.html
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP .5% Bausch + Lomb NDC 24208-730-06 https://www.bausch.com/ecp/our-products/rx-pharmaceuticals/generics
Regulator (tank dependent- 5% CO2: Fisherbrand Mulitstage Gas Cylinder Regulators) Genstar Technologies Company 10575150 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-multistage-cylinder-regulators-22/10575150?keyword=true
Regulator (tank dependent- Oxygen: Fisherbrand Multistage Gas Cylinder Regulators) Genstar Technologies Company 10575145 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-multistage-cylinder-regulators-22/10575145?keyword=true
Rubber Tubing (Inner diameter 19 mm, Outer diameter 27 mm), Made in House
Sealing tape- Parafilm Wrap (2" Wide) Cole Parmer PM992 https://www.coleparmer.com/i/parafilm-pm992-wrap-2-wide-250-ft-roll/0672050?PubID=VV&persist=True&ip=no&gclid=EAIaIQobChMInY3vqomz5QIVfyCtBh1VSg64EAAYASAAEgJ9n_D_BwE
Sterile Alcohol Prep Pads Medline MDS090670 https://www.medline.com/product/Sterile-Alcohol-Prep-Pads/Swab-Pads/Z05-PF03816
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP 1% Akorn NDC 17478-102-12 http://www.akorn.com/prod_detail.php?ndc=17478-102-12
Tubing Adapter, Made in House
Two-way non-rebreathing valve (2600 Series- Inner Diameter 28.6 mm, Outer Diameter 35 mm) Hans Rudolph 2600 Series, UM-112078 www.rudolphkc.com

Referencias

  1. Country, M. W. Retinal metabolism: A comparative look at energetics in the retina. Brain Research. 1672, 50-57 (2017).
  2. Ashimatey, B. S., Green, K. M., Chu, Z., Wang, R. K., Kashani, A. H. Impaired Retinal Vascular Reactivity in Diabetic Retinopathy as Assessed by Optical Coherence Tomography Angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (7), 2468 (2019).
  3. Hickam, J. B. M. D., Frayser, R. P. D. Studies of the Retinal Circulation in Man: Observations on Vessel Diameter, Arteriovenous Oxygen Difference, and Mean Circulation Time. Circulation. 33 (2), 302-316 (1966).
  4. Dorner, G. T., Garhoefer, G., Zawinka, C., Kiss, B., Schmetterer, L. Response of Retinal Blood Flow to CO2 -Breathing in Humans. European Journal of Ophthalmology. 12 (6), 459-466 (2002).
  5. Linsenmeier, R. A., Zhang, H. F. Retinal oxygen: from animals to humans. Progress in Retinal and Eye Research. 58, 115-151 (2017).
  6. Eliakim, M., Mor, I., Michaelson, I. C. Assessment of pharmacologic effects on the retinal circulation of hypertensive subjects by a quantitative method. Microvascular Research. 4 (4), 374-383 (1972).
  7. Gilmore, E. D., et al. Retinal arteriolar hemodynamic response to an acute hyperglycemic provocation in early and sight-threatening diabetic retinopathy. Microvascular Research. 73 (3), 191-197 (2007).
  8. Hickam, J. B., Sieker, H. O. Retinal Vascular Reactivity in Patients with Diabetes Mellitus and with Atherosclerosis. Circulation. 22 (2), 243-246 (1960).
  9. Gilmore, E. D., et al. Retinal Arteriolar Diameter, Blood Velocity, and Blood Flow Response to an Isocapnic Hyperoxic Provocation in Early Sight-Threatening Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (4), 1744 (2007).
  10. Garhofer, G. Reduced response of retinal vessel diameters to flicker stimulation in patients with diabetes. British Journal of Ophthalmology. 88 (7), 887-891 (2004).
  11. Felder, A. E., Wanek, J., Blair, N. P., Shahidi, M. Inner Retinal Oxygen Extraction Fraction in Response to Light Flicker Stimulation in Humans. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6633-6637 (2015).
  12. Rose, K., Flanagan, J. G., Patel, S. R., Cheng, R., Hudson, C. Retinal Blood Flow and Vascular Reactivity in Chronic Smokers. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4266 (2014).
  13. Omae, T., Nagaoka, T., Yoshida, A. Effects of Habitual Cigarette Smoking on Retinal Circulation in Patients With Type 2 Diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (3), 1345 (2016).
  14. Pusparajah, P., Lee, L. H., Abdul Kadir, K. Molecular Markers of Diabetic Retinopathy: Potential Screening Tool of the Future. Frontiers in Physiology. 7, (2016).
  15. Hammer, M., Vilser, W., Riemer, T., Schweitzer, D. Retinal vessel oximetry-calibration, compensation for vessel diameter and fundus pigmentation, and reproducibility. Journal of Biomedical Optics. 13 (5), 054015 (2008).
  16. Gilmore, E. D., Hudson, C., Preiss, D., Fisher, J. Retinal arteriolar diameter, blood velocity, and blood flow response to an isocapnic hyperoxic provocation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 288 (6), 2912-2917 (2005).
  17. Duan, A., Bedggood, P. A., Metha, A. B., Bui, B. V. Reactivity in the human retinal microvasculature measured during acute gas breathing provocations. Scientific Reports. 7 (1), 2113 (2017).
  18. Burns, S. A., Elsner, A. E., Sapoznik, K. A., Warner, R. L., Gast, T. J. Adaptive optics imaging of the human retina. Progress in Retinal and Eye Research. 68, 1-30 (2019).
  19. Kim, A. Y., Chu, Z., Shahidzadeh, A., Wang, R. K., Puliafito, C. A., Kashani, A. H. Quantifying Microvascular Density and Morphology in Diabetic Retinopathy Using Spectral-Domain Optical Coherence Tomography Angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
  20. Koulisis, N., et al. Quantitative microvascular analysis of retinal venous occlusions by spectral domain optical coherence tomography angiography. PLOS ONE. 12 (4), 0176404 (2017).
  21. Kim, A. Y., et al. Quantifying Retinal Microvascular Changes in Uveitis Using Spectral-Domain Optical Coherence Tomography Angiography. American Journal of Ophthalmology. 171, 101-112 (2016).
  22. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  23. Yu, D. Y., et al. Retinal capillary perfusion: Spatial and temporal heterogeneity. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 23-54 (2019).
  24. Tayyari, F., et al. The Relationship between Retinal Vascular Reactivity and Arteriolar Diameter in Response to Metabolic Provocation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4814 (2009).
  25. Lu, H., Liu, P., Yezhuvath, U., Cheng, Y., Marshall, O., Ge, Y. MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges. Journal of Visualized Experiments. (94), e52306 (2014).
  26. Reif, R., Qin, J., An, L., Zhi, Z., Dziennis, S., Wang, R. Quantifying Optical Microangiography Images Obtained from a Spectral Domain Optical Coherence Tomography System. International Journal of Biomedical Imaging. 2012, 1-11 (2012).
  27. Olafsdottir, O. B., Eliasdottir, T. S., Kristjansdottir, J. V., Hardarson, S. H., Stefánsson, E. Retinal Vessel Oxygen Saturation during 100% Oxygen Breathing in Healthy Individuals. PLOS ONE. 10 (6), 0128780 (2015).
  28. Kiss, B., et al. Retinal Blood Flow during Hyperoxia in Humans Revisited: Concerted Results Using Different Measurement Techniques. Microvascular Research. 64 (1), 75-85 (2002).
  29. Yezhuvath, U. S., Lewis-Amezcua, K., Varghese, R., Xiao, G., Lu, H. On the assessment of cerebrovascular reactivity using hypercapnia BOLD MRI. NMR in biomedicine. 22 (7), 779-786 (2009).
  30. Hardarson, S. H., et al. Automatic Retinal Oximetry. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (11), 5011 (2006).
  31. Sousa, D. C., Leal, I., Moreira, S., Dionísio, P., Abegão Pinto, L., Marques-Neves, C. Hypoxia challenge test and retinal circulation changes – a study using ocular coherence tomography angiography. Acta Ophthalmologica. 96 (3), 315-319 (2018).
  32. Slessarev, M., Somogyi, R., Preiss, D., Vesely, A., Sasano, H., Fisher, J. A. Efficiency of oxygen administration: Sequential gas delivery versus “flow into a cone” methods. Critical Care Medicine. 34 (3), 829-834 (2006).
  33. Gilmore, E. D., Hudson, C., Venkataraman, S. T., Preiss, D., Fisher, J. Comparison of Different Hyperoxic Paradigms to Induce Vasoconstriction: Implications for the Investigation of Retinal Vascular Reactivity. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (9), 3207 (2004).
  34. Shahidi, A. M., Patel, S. R., Huang, D., Tan, O., Flanagan, J. G., Hudson, C. Assessment of total retinal blood flow using Doppler Fourier Domain Optical Coherence Tomography during systemic hypercapnia and hypocapnia. Physiological Reports. 2 (7), 12046 (2014).
  35. Maleki, N., et al. The Effect of Hypercarbia and Hyperoxia on the Total Blood Flow to the Retina as Assessed by Magnetic Resonance Imaging. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (9), 6867 (2011).
  36. Smit, B., Smulders, Y. M., vander Wouden, J. C., Oudemans-van Straaten, H. M., Spoelstra-de Man, A. M. E. Hemodynamic effects of acute hyperoxia: systematic review and meta-analysis. Critical Care. 22 (1), 45 (2018).
  37. Piccolino, F. P., Cagini, C., Fruttini, D., Nicolò, M., Eandi, C. M., Tito, S. Retinal Vascular Reactivity in Central Serous Chorioretinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4425 (2018).
  38. Sousa, D. C., et al. A Protocol to Evaluate Retinal Vascular Response Using Optical Coherence Tomography Angiography. Frontiers in Neuroscience. 13, 566 (2019).
  39. Robinson, F., Riva, C. E., Grunwald, J. E., Petrig, B. L., Sinclair, S. H. Retinal Blood Flow Autoregulation in Response to on Acute Increase in Blood Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (5), 5 (1986).
  40. Gherghel, D., Hosking, S. L., Cunliffe, I. A. Abnormal Systemic and Ocular Vascular Response to Temperature Provocation in Primary Open-Angle Glaucoma Patients: A Case for Autonomic Failure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3546 (2004).
  41. You, Q., et al. Reproducibility of vessel density measurement with Optical Coherence Tomography Angiography in eyes with and without retinopathy. Retina. 37 (8), 1475-1482 (2017).
  42. Lei, J., et al. Repeatability and Reproducibility of Superficial Macular Retinal Vessel Density Measurements Using Optical Coherence Tomography Angiography En Face Images. JAMA Ophthalmology. 135 (10), 1092 (2017).
  43. Czakó, C., et al. Intrasession and Between-Visit Variability of Retinal Vessel Density Values Measured with OCT Angiography in Diabetic Patients. Scientific Reports. 8 (1), 10598 (2018).
  44. Field, A. S., Laurienti, P. J., Yen, Y. F., Burdette, J. H., Moody, D. M. Dietary Caffeine Consumption and Withdrawal: Confounding Variables in Quantitative Cerebral Perfusion Studies. Radiology. 227 (1), 129-135 (2003).
  45. Baek, S. U., et al. Diurnal change of retinal vessel density and mean ocular perfusion pressure in patients with open-angle glaucoma. PLOS ONE. 14 (4), 0215684 (2019).
  46. Müller, V. C., Storp, J. J., Kerschke, L., Nelis, P., Eter, N., Alnawaiseh, M. Diurnal variations in flow density measured using optical coherence tomography angiography and the impact of heart rate, mean arterial pressure and intraocular pressure on flow density in primary open-angle glaucoma patients. Acta Ophthalmologica. 97 (6), (2019).
  47. Sarwar, S., et al. Diurnal variation of choriocapillaris vessel flow density in normal subjects measured using optical coherence tomography angiography. International Journal of Retina and Vitreous. 4 (1), 37 (2018).
  48. Liu, P., De Vis, J. B., Lu, H. Cerebrovascular reactivity (CVR) MRI with CO2 challenge: A technical review. NeuroImage. 187, 104-115 (2019).
  49. Ting, D. S. W., et al. Optical Coherence Tomographic Angiography in Type 2 Diabetes and Diabetic Retinopathy. JAMA Ophthalmology. 135 (4), 306 (2017).
  50. Spaide, R. F., Fujimoto, J. G., Waheed, N. K., Sadda, S. R., Staurenghi, G. Optical coherence tomography angiography. Progress in retinal and eye research. 64, 1-55 (2018).
  51. An, D., et al. Quantitative comparisons between optical coherence tomography angiography and matched histology in the human eye. Experimental Eye Research. 170, 13-19 (2018).

Play Video

Citar este artículo
Kushner-Lenhoff, S., Ashimatey, B. S., Kashani, A. H. Retinal Vascular Reactivity as Assessed by Optical Coherence Tomography Angiography. J. Vis. Exp. (157), e60948, doi:10.3791/60948 (2020).

View Video