İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması
Summary
Lazer mikrodisesi ( LMD) glioma heterojenite ve invazyon aracılık yolları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek hassas ve son derece tekrarlanabilir bir tekniktir. Burada lazer LMD kullanarak glioma dokusundan ayrık alanları izole etmek ve ardından transkripsiyonanalizi yapmak için optimize edilmiş bir protokol tanımlıyoruz.
Abstract
Gliomlar invazivlik leri ve heterojenlikleri ile karakterize primer beyin tümörleridir. Psödopalisatlar, mikrovasküler proliferasyon, mezenkimal transformasyon ve nekroz gibi spesifik histolojik paternler yüksek dereceli gliomların histolojik heterojenliğini karakterize eder. Laboratuvarımız, oncostreams adı verilen mezenkimal hücrelerin yüksek yoğunluklarının varlığının tümör malignitesi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Glioma’nın büyüme ve istilasının altında yatan mekanizmaları anlamak için eşsiz bir yaklaşım geliştirdik. Burada, intra-tümöral heterojen multisellüler yapıların diferansiyel mRNA ekspresyonunu (yani mezenkimal alanlar veya tümör invazyonu alanları) analiz etmek için lazer yakalama mikrodizesi (LMD) ve RNA dizilimi kullanan kapsamlı bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem iyi doku histolojisi ve RNA bütünlüğünü korur. Perfüzyon, donma, gömme, kesit ve boyama morfolojisini korumak ve yüksek kaliteli lazer mikrodiskes örnekleri elde etmek için optimize edildi. Sonuçlar, %30 sakaroz kullanan glioma taşıyan farelerin perfüzyonunun iyi morfoloji ve RNA kalitesi sağladığını göstermektedir. Buna ek olarak,% 4 Cresyl menekşe ve% 0.5 eozin ile tümör bölümleri boyama iyi nükleer ve hücresel boyama ile sonuçlanır, RNA bütünlüğünü korurken. Açıklanan yöntem hassas ve son derece tekrarlanabilir ve çeşitli tümör modellerinde tümör morfolojisi çalışmak için kullanılabilir. Özetle, katı tümörler deki heterojen çok hücreli yapıların moleküler özelliklerini incelemek için sıralama için morfolojive RNA kalitesini koruyan LMD’yi gerçekleştirmek için tam bir yöntem açıklıyoruz.
Introduction
Gliomas merkezi sinir sisteminin en agresif primer tümörlerdir. Onlar son derece invaziv ve heterojen1. Tümörün hücresel ve moleküler bileşenlerinin analizi yeni terapötik hedefleri ortaya çıkaracaktır.
Şu anda mevcut farklı yöntemler arasında, dondurulmuş beyin tümör dokusunun lazer yakalama mikrodizması (LMD) kendi moleküler profil2,3çalışma tümör dokularından ayrık anatomik alanların veya belirli hücre popülasyonlarının izolasyon sağlayan bir maliyet-etkin, güvenilir bir tekniktir., LMD seçilen tek hücre veya çok hücreli yapıların mRNA gen ekspresyon profillerianalizi sağlar4,5. LMD tümör ilerlemesi sırasında meydana gelen moleküler olaylar hakkında derinlemesine mekanik bilgi kazanmak için kullanılabilir. Doku morfolojisi ve RNA kalitesinde6’nınen uygun optik çözünürlüğünü elde etmek için tümör dokularının işlenmesinde iyileştirme gereklidir. Paraformaldehit fiksasyonu morfolojik analiz için en iyi seçenek olmasına rağmen, RNA kalitesi etkilenir ve bu koşullar altında bozulur, RNA-seq analizi için düşük RNA kalitesi ile sonuçlanır. Dondurulmuş doku bölümlerinin kullanımı hücre zarlarını kırmak ve hücreler içinde delik üretebilir buz kristaloluşumunu önler, ve RNA-Seq analizi için en iyi seçenek kalır7.
Burada, LMD için dondurulmuş fare beyin tümörü dokuları işlemek için optimize edilmiş bir kesit fiksasyon ve boyama yöntemi açıklar. Dokuda buz kristallerinin oluşmasını önlemek için fareleri %30 sakaroz çözeltisi ile perfüzyonladık. Bu çözelti kutup su molekülleri arasındaki etkileşimleri bozar ve doku morfolojisini koruyarak buz kristallerinin oluşumunu önler. Doku boyama ayırt etmek ve tümör içinde hücrelerin veya anatomik olarak farklı alanlarda belirli nüfus elde etmek için gereklidir. RNA bütünlüğünü korumak için dokuyu zararsız boyalarla onarmak ve lekelemek esastır. Daha önce hematoksilin/eozin (H&E) ile boyama dokusunun RNA bütünlüğünü bozdığı gösterilmiştir8. Biz sabit ve etanol, Cresyl menekşe% 4 ve eozin Y 0.5% çözümleri ile ilgi doku lekeli. Cresyl menekşe koyu mavi renk ile hücre çekirdeği lekeler asiofilik boya. Eozin Y hücrelerin temel bileşenleri lekeler bir bazofilik boya, sitoplazma ve diğer hücresel yapılar arasında bir ayrım sağlayan8. Her iki boya da etanolde çözünür ve RNA kalitesini bozmaz. Doku hasarını önlemek ve hücresel yapıların yüksek optik çözünürlüğünü korumak için, DOKU KESİmLERINI LMD9’danönce monte ettik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glioma heterojenitesinin ve invazyonunun altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması, yeni terapötik hedefleri ortaya çıkarmak için kritik öneme sahiptir13. Bu yazıda, lazer yakalama mikrodisyonu (LMD) kullanılarak glioma heterojenitesinin ve istilasının moleküler manzarasını analiz etmek ve ardından transkripsiyonanalizini yapmak için ayrıntılı ve optimize edilmiş bir yöntem açıklanmıştır.
Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LMD) tümö…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH/NINDS) Hibeleri tarafından desteklendi: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 to M.G.C.; (NIH/NINDS) R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311’den P.R.L.’ye hibeler; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; Nöroşirürji Bölümü, Michigan Üniversitesi Rogel Kanser Merkezi, ChadTough Vakfı ve Leah’s Happy Hearts Vakfı M.G.C. ve P.R.L. RNA Biyotıp Hibe F046166 M.G.C. Ulusal Sağlık Enstitüleri, UL1 TR002240 Michigan Klinik ve Sağlık Araştırma Enstitüsü (MICHR), Doktora Sonrası Çeviri Akademisyenler Programı (PTSP) hibe, hibe Proje F049768 Michigan Üniversitesi Forbes Kanser Araştırma Enstitüsü, Körlük Önlemek Için Araştırma bir Hekim-Bilim Adamı Ödülü, Inc (RPB), NIH (AK) NEI R01 EY022633 hibe ve RPB oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü için sınırsız hibe. Bu araştırmada Görme Araştırma Çekirdeği (P30 EY007003) ve Kanser Merkezi Araştırma Çekirdeği (P30 CA046592) kullanılmıştır. AK, A. Alfred Taubman Tıbbi Araştırma Enstitüsü’nden Bayan William Davidson Emerging Scholar Ödülü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
Referencias
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas – implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Rabien, A., Kristiansen, G. Tissue Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).
- Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection. Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).
- Núñez, F. J., et al. IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response. Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Brat, D. J., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing. Science. 358 (6359), 64-69 (2017).
- Gagner, J. P., Zagzag, D. Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).
