Microdissezione di cattura laser delle sottoregioni del Glioma per la caratterizzazione spaziale e molecolare dell'eterogeneità intratutuale, dell'Oncoflusso e dell'invasione
Summary
La microdissezione laser (LMD) è una tecnica sensibile e altamente riproducibile che può essere utilizzata per scoprire percorsi che mediano l’eterogeneità e l’invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare le aree discrete dal tessuto glioma utilizzando LMD laser seguito da analisi trascrittomica.
Abstract
I gliomi sono tumori cerebrali primari caratterizzati dalla loro invasività e eterogeneità. Modelli istologici specifici come pseudopalisades, proliferazione microvascolare, trasformazione mesenchymic e necrosi caratterizzano l’eterogeneità istologica dei gliomi di alta qualità. Il nostro laboratorio ha dimostrato che la presenza di alte densità di cellule mesenchymal, chiamate oncostream, correla con la malignità tumorale. Abbiamo sviluppato un approccio unico per comprendere i meccanismi alla base della crescita e dell’invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo completo che utilizza la microdissezione di cattura laser (LMD) e il sequenziamento dell’RNA per analizzare l’espressione mRNA differenziale delle strutture multicellulari eterogenee intra-tumorali (cioè aree mesenchymal o aree di invasione del tumore). Questo metodo mantiene una buona istologia dei tessuti e l’integrità dell’RNA. Perfusione, congelamento, incorporamento, sezionamento e colorazione sono stati ottimizzati per preservare la morfologia e ottenere campioni di microdissezione laser di alta qualità. I risultati indicano che la perfusione di topi portanti con glioma utilizzando il 30% di saccarosio fornisce una buona morfologia e qualità dell’RNA. Inoltre, colorare le sezioni tumorali con 4% Cresyl viola e 0.5% eosina si traduce in una buona colorazione nucleare e cellulare, pur preservando l’integrità dell’RNA. Il metodo descritto è sensibile e altamente riproducibile e può essere utilizzato per studiare la morfologia tumorale in vari modelli tumorali. In sintesi, descriviamo un metodo completo per eseguire LMD che conserva la morfologia e la qualità dell’RNA per il sequenziamento per studiare le caratteristiche molecolari delle strutture multicellulari eterogenee all’interno dei tumori solidi.
Introduction
I gliomi sono i tumori primari più aggressivi del sistema nervoso centrale. Sono altamente invasivi ed eterogenei1. L’analisi dei componenti cellulari e molecolari del tumore rivelerà nuovi bersagli terapeutici.
Tra i diversi metodi attualmente disponibili, la microdissezione di cattura laser (LMD) del tessuto tumorale del cervello congelato è una tecnica affidabile e conveniente che consente l’isolamento di aree anatomiche discrete o specifiche popolazioni cellulari dai tessuti tumorali per studiare il loro profilo molecolare2,3. LMD consente l’analisi dei profili di espressione genica mRNA di singole cellule selezionate o strutture multicellulari4,5. LMD può essere utilizzato per acquisire conoscenze meccanicistiche approfondite sugli eventi molecolari che si svolgono durante la progressione del tumore. Il miglioramento nella lavorazione dei tessuti tumorali è necessario per ottenere una risoluzione ottica ottimale della morfologia dei tessuti e della qualità dell’RNA6. Anche se la fissazione della paraformaldeide è l’opzione migliore per l’analisi morfologica, la qualità dell’RNA è influenzata e degradata in queste condizioni, con conseguente scarsa qualità dell’RNA per l’analisi RNA-seq. L’uso di sezioni di tessuto congelato evita la formazione di cristalli di ghiaccio, che potrebbero rompere le membrane cellulari e produrre fori all’interno delle cellule, e rimane l’opzione migliore per l’analisi RNA-Seq7.
Qui, descriviamo un metodo ottimizzato di fissazione e colorazione delle sezioni per elaborare i tessuti tumorali del cervello del topo congelato per LMD. Per evitare che i cristalli di ghiaccio si formino nel tessuto, abbiamo perfuso i topi con una soluzione di saccarosio del 30%. Questa soluzione interrompe le interazioni tra molecole di acqua polare e impedisce la formazione di cristalli di ghiaccio, preservando la morfologia dei tessuti. La colorazione dei tessuti è necessaria per differenziare e ottenere una popolazione specifica di cellule o aree anatomicamente distinte all’interno del tumore. È essenziale fissare e macchiare il tessuto con coloranti innocui per mantenere l’integrità dell’RNA. È stato precedentemente dimostrato che la colorazione del tessuto con ematossina/eosina (H&E) deteriora l’integrità dell’RNA8. Abbiamo fissato e macchiato il tessuto di interesse con etanolo, Cresyl viola 4% e eosin Y 0.5% soluzioni. Cresyl violet è un colorante acidofilo che macchia il nucleo cellulare con un colore blu scuro. Eosin Y è un coloranti basofilo che macchia i componenti di base delle cellule, fornendo una distinzione tra citoplasma e altre strutture cellulari8. Entrambi i coloranti sono solubili in etanolo e non deteriorano la qualità dell’RNA. Per evitare danni ai tessuti e mantenere un’elevata risoluzione ottica delle strutture cellulari, abbiamo montato le sezioni di tessuto primadell’LMD 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprendere i meccanismi molecolari alla base dell’eterogeneità e dell’invasione del glioma è di fondamentale importanza per scoprire nuovi obiettivi terapeutici13. In questo manoscritto, descriviamo un metodo dettagliato e ottimizzato per analizzare il paesaggio molecolare dell’eterogeneità e dell’invasione del glioma usando la microdissezione di cattura laser (LMD) seguita dall’analisi trascrittomica.
La microdissezione di cattura laser (LMD) può essere utilizzata…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni dei National Institutes of Health (NIH/NINDS): R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 a M.G.C.; (NIH/NINDS) Concede R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 a P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; il Dipartimento di Neurochirurgia, il Rogel Cancer Center dell’Università del Michigan, la Fondazione ChadTough e la Fondazione Happy Hearts di Leah a M.G.C. e P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 a M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 per l’Istituto per la ricerca clinica e sanitaria (MICHR), il programma di borse di studio per la traduzione post-istituzionale (PTSP), grant, Grant, Grant, Grant, Grant, Il progetto F049768 presso l’Università del Michigan Forbes Cancer Research Institute, un Physician-Scientist Award della Research to Prevent Blindness, Inc. (RPB), concede R01 EY022633 dal NEI del NIH (AK), e una sovvenzione illimitata di RPB al Dipartimento di Oftalimologia e Scienze Visive. Questa ricerca ha utilizzato il Vision Research Core (P30 EY007003) e il Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK è sostenuto dal premio William Davidson Emerging Scholar Award dell’A. Alfred Taubman Medical Research Institute.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
Referencias
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