Microdissection laser de sous-régions de Glioma pour la caractérisation spatiale et moléculaire de l’hétérogénéité intratumorale, des oncostreams et de l’invasion
Summary
La microdissection laser (LMD) est une technique sensible et hautement reproductible qui peut être utilisée pour découvrir des voies qui médité glioma hétérogénéité et invasion. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour isoler les zones discrètes du tissu de gliome utilisant le LMD laser suivi de l’analyse transcriptomique.
Abstract
Les gliomes sont des tumeurs cérébrales primaires caractérisées par leur invasivité et leur hétérogénéité. Des modèles histologiques spécifiques tels que les pseudopalisades, la prolifération microvasculaire, la transformation mésenchymale et la nécrose caractérisent l’hétérogénéité histologique des gliomes de haute qualité. Notre laboratoire a démontré que la présence de densités élevées de cellules mésenchymales, nommées oncostreams, corrèlent avec la malignité de tumeur. Nous avons développé une approche unique pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent la croissance et l’invasion du gliome. Ici, nous décrivons un protocole complet qui utilise la microdissection de capture de laser (LMD) et le séquençage d’ARN pour analyser l’expression différentiele d’ARNm des structures multicellulaires intra-tumorales (c.-à-d. les secteurs mésenchymal ou les secteurs de l’invasion de tumeur). Cette méthode maintient une bonne histologie tissulaire et l’intégrité de l’ARN. La perfusion, la congélation, l’intégration, la section et la coloration ont été optimisées pour préserver la morphologie et obtenir des échantillons de microdissection laser de haute qualité. Les résultats indiquent que la perfusion de souris porteuses de gliome utilisant 30% de saccharose fournit une bonne morphologie et la qualité d’ARN. En outre, les sections de tumeur de coloration avec 4% de violette de Cresyl et 0.5% d’éosine a comme conséquence la bonne coloration nucléaire et cellulaire, tout en préservant l’intégrité d’ARN. La méthode décrite est sensible et hautement reproductible et elle peut être employée pour étudier la morphologie de tumeur dans divers modèles de tumeur. En résumé, nous décrivons une méthode complète pour effectuer LMD qui préserve la morphologie et la qualité d’ARN pour le séquençage pour étudier les dispositifs moléculaires des structures multicellulaires hétérogènes dans les tumeurs solides.
Introduction
Les gliomes sont les tumeurs primaires les plus agressives du système nerveux central. Ils sont très envahissants et hétérogènes1. L’analyse des composants cellulaires et moléculaires de la tumeur révélera de nouvelles cibles thérapeutiques.
Parmi les différentes méthodes actuellement disponibles, la microdissection de capture laser (LMD) du tissu tumoral congelé est une technique rentable et fiable qui permet l’isolement des zones anatomiques discrètes ou des populations cellulaires spécifiques des tissus tumoraux pour étudier leur profil moléculaire2,3. LMD permet l’analyse des profils d’expression des gènes de l’ARNm de certaines cellules individuelles ou structures multicellulaires4,5. LMD peut être utilisé pour acquérir des connaissances mécanistes approfondies sur les événements moléculaires qui ont lieu pendant la progression tumorale. Amélioration dans le traitement des tissus tumoraux est nécessaire pour obtenir une résolution optique optimale de la morphologie tissulaire et de la qualité de l’ARN6. Bien que la fixation du paraformaldéhyde soit la meilleure option pour l’analyse morphologique, la qualité de l’ARN est affectée et dégradée dans ces conditions, ce qui entraîne une mauvaise qualité d’ARN pour l’analyse ARN-seq. L’utilisation de sections de tissu congelé évite la formation de cristaux de glace, qui pourrait briser les membranes cellulaires et produire des trous dans les cellules, et reste la meilleure option pour l’analyse ARN-Seq7.
Ici, nous décrivons une méthode optimisée de fixation et de coloration de section pour traiter les tissus congelés de tumeur de cerveau de souris pour LMD. Pour empêcher la formation de cristaux de glace dans le tissu, nous avons perfusé les souris avec une solution de saccharose de 30%. Cette solution perturbe les interactions entre les molécules d’eau polaire et empêche la formation de cristaux de glace, préservant la morphologie tissulaire. La coloration des tissus est nécessaire pour différencier et obtenir une population spécifique de cellules ou des zones anatomiquement distinctes dans la tumeur. Il est essentiel de fixer et de tacher le tissu avec des colorants inoffensifs pour maintenir l’intégrité de l’ARN. Il a été précédemment montré que le tissu de coloration avec l’hématoxyline/eosine (H et E) détériore l’intégrité de l’ARN8. Nous avons fixé et taché le tissu d’intérêt avec l’éthanol, Cresyl violet 4% et eosin Y 0.5% solutions. La violette de cresyl est un colorant acidophile qui tache le noyau cellulaire avec une couleur bleu foncé. Eosin Y est un colorant basophile qui tache les composants de base des cellules, offrant une distinction entre le cytoplasme et d’autres structures cellulaires8. Les deux colorants sont solubles dans l’éthanol et ne détériorent pas la qualité de l’ARN. Pour éviter les lésions tissulaires et maintenir une haute résolution optique des structures cellulaires, nous avons monté les sections tissulaires avant LMD9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’hétérogénéité et à l’invasion du gliome sont d’une importance cruciale pour découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques13. Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode détaillée et optimisée pour analyser le paysage moléculaire de l’hétérogénéité et de l’invasion du gliome à l’aide de la microdissection de capture laser (LMD) suivie d’une analyse transcriptomique.
La microdiss…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux ont été soutenus par les National Institutes of Health (NIH/NINDS) Subventions: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 à M.G.C.; (NIH/NINDS) Subventions R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 à P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; le Département de neurochirurgie, le Rogel Cancer Center de l’Université du Michigan, la ChadTough Foundation et la Happy Hearts Foundation de Leah à M.G.C. et P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 à M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 pour le Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) Le projet F049768 à l’Institut forbes de recherche sur le cancer de l’Université du Michigan, un prix médecin-scientifique de la recherche pour prévenir la cécité, Inc. (RPB), accorde R01 EY022633 de l’ONI des NIH (AK) et une subvention sans restriction de la RPB au Département d’ophtalmologie et de sciences visuelles. Cette recherche a utilisé le Centre de recherche de la vision (P30 EY007003) et le Centre de recherche du Centre de cancérologie (P30 CA046592). AK est soutenu par le Prix De la recherche émergente Mme William Davidson de l’Institut de recherche médicale A. Alfred Taubman.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
Referencias
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas – implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Rabien, A., Kristiansen, G. Tissue Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).
- Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection. Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).
- Núñez, F. J., et al. IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response. Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Brat, D. J., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing. Science. 358 (6359), 64-69 (2017).
- Gagner, J. P., Zagzag, D. Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).
