Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão
Summary
A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.
Abstract
Gliomas são tumores cerebrais primários caracterizados por sua invasividade e heterogeneidade. Padrões histológicos específicos como pseudopalisades, proliferação microvascular, transformação mesenquimal e necrose caracterizam a heterogeneidade histológica de gliomas de alto grau. Nosso laboratório demonstrou que a presença de altas densidades de células mesenquimais, denominadas oncostreams, se correlacionam com a malignidade tumoral. Desenvolvemos uma abordagem única para entender os mecanismos que estão por trás do crescimento e da invasão de Glioma. Aqui, descrevemos um protocolo abrangente que utiliza microdissecção de captura a laser (LMD) e sequenciamento de RNA para analisar a expressão diferencial de mRNA de estruturas multicelulares heterogêneas intratumorais (ou seja, áreas mesenquimais ou áreas de invasão de tumor). Este método mantém boa histologia tecidual e integridade do RNA. Perfusão, congelamento, incorporação, secção e coloração foram otimizadas para preservar a morfologia e obter amostras de microdissecção a laser de alta qualidade. Os resultados indicam que a perfusão de camundongos portadores de glioma usando 30% de sacarose fornece boa morfologia e qualidade de RNA. Além disso, as seções de tumor de coloração com 4% de cresípia violeta e 0,5% de eosina resultam em boa coloração nuclear e celular, preservando a integridade do RNA. O método descrito é sensível e altamente reprodutível e pode ser utilizado para estudar a morfologia tumoral em vários modelos tumorais. Em resumo, descrevemos um método completo para realizar ODL que preserva a morfologia e a qualidade do RNA para sequenciamento para estudar as características moleculares de estruturas multicelulares heterogêneas dentro de tumores sólidos.
Introduction
Gliomas são os tumores primários mais agressivos do sistema nervoso central. São altamente invasivos e heterogêneos1. A análise dos componentes celulares e moleculares do tumor revelará novos alvos terapêuticos.
Entre os diferentes métodos disponíveis atualmente, a microdissecção de captura a laser (DLM) do tecido tumoral cerebral congelado é uma técnica econômica e confiável que permite o isolamento de áreas anatômicas discretas ou populações celulares específicas de tecidos tumorais para estudar seu perfil molecular2,3. O LMD permite a análise de perfis de expressão genética mRNA de células individuais selecionadas ou estruturas multicelulares4,5. O LMD pode ser utilizado para obter conhecimento mecanicista aprofundado sobre os eventos moleculares que ocorrem durante a progressão do tumor. A melhoria no processamento dos tecidos tumorais é necessária para obter a resolução óptica ideal da morfologia tecidual e da qualidade do RNA6. Embora a fixação do paraformaldeído seja a melhor opção para a análise morfológica, a qualidade do RNA é afetada e degradada nessas condições, resultando em má qualidade do RNA para análise de RNA-seq. O uso de seções de tecido congelado evita a formação de cristais de gelo, que poderia quebrar membranas celulares e produzir buracos dentro das células, e continua sendo a melhor opção para a análise de RNA-Seq7.
Aqui, descrevemos um método otimizado de fixação e coloração de seção para processar tecidos tumorais cerebrais congelados para LMD. Para evitar que cristais de gelo se formassem no tecido, perfundamos camundongos com uma solução de 30% de sacarose. Esta solução interrompe as interações entre moléculas de água polar e impede a formação de cristais de gelo, preservando a morfologia tecidual. A coloração tecidual é necessária para diferenciar e obter população específica de células ou áreas anatomicamente distintas dentro do tumor. É essencial fixar e manchar o tecido com corantes inócuos para manter a integridade do RNA. Foi demonstrado anteriormente que o tecido de coloração com hematoxilina/eosina (H&E) deteriora a integridade do RNA8. Corrigimos e manchamos o tecido de juros com etanol, cresyl violeta 4% e eosiny y 0,5% soluções. Cresyl violeta é um corante acidofílico que mancha o núcleo celular com uma cor azul escuro. EosinY é um tine basofílico que mancha componentes básicos das células, proporcionando uma distinção entre citoplasma e outras estruturas celulares8. Ambos os corantes são solúveis em etanol e não deterioram a qualidade do RNA. Para evitar danos teciduais e manter alta resolução óptica das estruturas celulares, montamos as seções teciduais antes do LMD9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Compreender os mecanismos moleculares subjacentes à heterogeneidade e invasão do glioma são de importância crítica para descobrir novos alvos terapêuticos13. Neste manuscrito, descrevemos um método detalhado e otimizado para analisar a paisagem molecular da heterogeneidade e invasão de glioma usando microdissecção de captura a laser (LMD) seguida de análise transcritiva.
A microdissecção de captura a laser (DMD) pode ser usada para identificar diferentes á…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, (NIH/NINDS) Subsídios: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 a M.G.C.; (NIH/NINDS) Subsídios R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 a P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; o Departamento de Neurocirurgia, O Centro de Câncer rogel na Universidade de Michigan, ChadTough Foundation, e Leah’s Happy Hearts Foundation para M.G.C. e P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 para M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) grant, Projeto F049768 para A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, um Prêmio Médico-Cientista de Pesquisa para Prevenir a Cegueira, Inc. (RPB), subvenção R01 EY022633 do NEI do NIH (AK), e uma subvenção irrestrita da RPB para o Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais. Esta pesquisa utilizou o Vision Research Core (P30 EY007003) e o Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK é apoiada pelo Prêmio Acadêmico Emergente Mrs. William Davidson do A. Alfred Taubman Medical Research Institute.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
Referencias
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas – implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Rabien, A., Kristiansen, G. Tissue Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).
- Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection. Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).
- Núñez, F. J., et al. IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response. Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Brat, D. J., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing. Science. 358 (6359), 64-69 (2017).
- Gagner, J. P., Zagzag, D. Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).
