Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion
Summary
Lasermikrodissektion (LMD) ist eine empfindliche und hochreproduzierbare Technik, die verwendet werden kann, um Wege aufzudecken, die Gliomheterogenität und Invasion vermitteln. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Isolierung diskreter Bereiche aus Gliomgewebe mittels Laser LMD, gefolgt von transkriptomischer Analyse.
Abstract
Gliome sind primäre Hirntumoren, die sich durch ihre Invasivität und Heterogenität auszeichnen. Spezifische histologische Muster wie Pseudopalisaden, mikrovaskuläre Proliferation, mesenchymale Transformation und Nekrose charakterisieren die histologische Heterogenität hochwertiger Gliome. Unser Labor hat gezeigt, dass das Vorhandensein von hohen Dichten von mesenchymalen Zellen, die Oncostreams genannt werden, mit Tumormalignität korreliert. Wir haben einen einzigartigen Ansatz entwickelt, um die Mechanismen zu verstehen, die dem Wachstum und der Invasion von Glioma zugrunde liegen. Hier beschreiben wir ein umfassendes Protokoll, das Lasercapture Microdissection (LMD) und RNA-Sequenzierung nutzt, um die differenzielle mRNA-Expression intratumoraler heterogener multizellulärer Strukturen (d. h. mesenchymale Bereiche oder Bereiche der Tumorinvasion) zu analysieren. Diese Methode bewahrt eine gute Gewebehistologie und RNA-Integrität. Perfusion, Einfrieren, Einbetten, Schnitt und Färbung wurden optimiert, um die Morphologie zu erhalten und hochwertige Lasermikrodissektionsproben zu erhalten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Perfusion von Gliom-tragenden Mäusen mit 30% Saccharose eine gute Morphologie und RNA-Qualität bietet. Darüber hinaus führt die Färbung von Tumorabschnitten mit 4% Cresylviolett und 0,5% Eosin zu einer guten kern- und zellulären Färbung unter Beibehaltung der RNA-Integrität. Die beschriebene Methode ist empfindlich und hochreproduzierbar und kann verwendet werden, um Tumormorphologie in verschiedenen Tumormodellen zu studieren. Zusammenfassend beschreiben wir eine vollständige Methode zur Durchführung von LMD, die Morphologie und RNA-Qualität für die Sequenzierung bewahrt, um die molekularen Merkmale heterogener multizellulärer Strukturen innerhalb solider Tumoren zu untersuchen.
Introduction
Gliome sind die aggressivsten Primärtumoren des zentralen Nervensystems. Sie sind hochinvasiv und heterogen1. Die Analyse zellulärer und molekularer Komponenten des Tumors wird neue therapeutische Ziele aufzeigen.
Unter verschiedenen derzeit verfügbaren Methoden ist die Lasercapture-Mikrodissektion (LMD) von gefrorenem Hirntumorgewebe eine kostengünstige, zuverlässige Technik, die die Isolierung diskreter anatomischer Bereiche oder spezifischer Zellpopulationen aus Tumorgeweben ermöglicht, um ihr molekulares Profil zu untersuchen2,3. LMD ermöglicht die Analyse von mRNA-Genexpressionsprofilen ausgewählter Einzelzellen oder multizellulärer Strukturen4,5. LMD kann genutzt werden, um tiefgehendes mechanistisches Wissen über die molekularen Ereignisse zu gewinnen, die während der Tumorprogression stattfinden. Eine Verbesserung der Verarbeitung von Tumorgeweben ist notwendig, um eine optimale optische Auflösung der Gewebemorphologie und der RNA-Qualität6zu erhalten. Obwohl paraformaleDehyd-Fixierung die beste Option für die morphologische Analyse ist, wird die RNA-Qualität unter diesen Bedingungen beeinflusst und herabgestuft, was zu einer schlechten RNA-Qualität für die RNA-Seq-Analyse führt. Die Verwendung von gefrorenen Gewebeabschnitten vermeidet die Bildung von Eiskristallen, die Zellmembranen brechen und Löcher in Zellen produzieren könnten, und bleibt die beste Option für die RNA-Seq-Analyse7.
Hier beschreiben wir eine optimierte Abschnittsfixierungs- und Färbemethode zur Verarbeitung von gefrorenem Hirntumorgewebe der Maus für LMD. Um zu verhindern, dass sich Eiskristalle im Gewebe bilden, haben wir Mäuse mit einer Lösung von 30% Saccharose durchdrungen. Diese Lösung stört Wechselwirkungen zwischen polaren Wassermolekülen und verhindert die Bildung von Eiskristallen, wodurch die Gewebemorphologie erhalten bleibt. Gewebefärbung ist notwendig, um zu differenzieren und spezifische Population von Zellen oder anatomisch unterschiedliche Bereiche innerhalb des Tumors zu erhalten. Es ist wichtig, das Gewebe mit harmlosen Farbstoffen zu fixieren und zu färben, um die RNA-Integrität zu erhalten. Es wurde bereits gezeigt, dass Färbegewebe mit Hämatoxylin/Eosin (H&E) die RNA-Integrität verschlechtert8. Wir fixierten und färbten das Gewebe von Interesse mit Ethanol, Cresyl violett 4% und Eosin Y 0,5% Lösungen. Cresylviolett ist ein acidophiler Farbstoff, der den Zellkern mit einer dunkelblauen Farbe färbt. Eosin Y ist ein basophiler Farbstoff, der grundlegende Bestandteile der Zellen färbt und eine Unterscheidung zwischen Zytoplasma und anderen zellulären Strukturen bietet8. Beide Farbstoffe sind in Ethanol löslich und verschlechtern die RNA-Qualität nicht. Um Gewebeschäden zu vermeiden und eine hohe optische Auflösung der zellulären Strukturen zu erhalten, haben wir die Gewebeabschnitte vor LMD9montiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Gliomheterogenität und -invasion zugrunde liegen, ist von entscheidender Bedeutung, um neue therapeutische Ziele aufzudecken13. In diesem Manuskript beschreiben wir eine detaillierte und optimierte Methode zur Analyse der molekularen Landschaft der Gliomheterogenität und Invasion mittels Laser capture microdissection (LMD) gefolgt von transkriptomischer Analyse.
Lasercapture Microdissection (LMD) kann verwendet wer…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeiten wurden von den National Institutes of Health,(NIH/NINDS) Grants: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 to M.G.C.; (NIH/NINDS) Zuschüsse R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 an P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; das Department of Neurosurgery, Rogel Cancer Center an der University of Michigan, ChadTough Foundation, und Leah es Happy Hearts Foundation an M.G.C. und P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 an M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) Grant, Project F049768 an A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, ein Physician-Scientist Award von Research to Prevent Blindness, Inc. (RPB), Stipendium R01 EY022633 von der NEI des NIH (AK) und ein uneingeschränktes Stipendium des RPB an das Department of Ophthalmology and Visual Sciences. Diese Forschung nutzte den Vision Research Core (P30 EY007003) und den Cancer Center Research Core (P30 CA046592). Die AK wird durch den Mrs. William Davidson Emerging Scholar Award des A. Alfred Taubman Medical Research Institute unterstützt.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
Referencias
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