Laser Capture Microdissection af Glioma subregions for rumlige og molekylære karakterisering af intratumoral heterogenitet, Oncostreams, og Invasion
Summary
Laser microdissection (LMD) er en følsom og meget reproducerbar teknik, der kan bruges til at afdække veje, der mægle gliom heterogenitet og invasion. Her beskriver vi en optimeret protokol til at isolere diskrete områder fra gliomvæv ved hjælp af laser LMD efterfulgt af transskriptionsanalyse.
Abstract
Gliomer er primære hjernetumorer karakteriseret ved deres invasiv og heterogenitet. Specifikke histologiske mønstre såsom pseudopalisader, mikrovaskulær spredning, mesenkymale transformation og nekrose karakteriserer den histologiske heterogenitet af højkvalitet gliomer. Vores laboratorium har vist, at tilstedeværelsen af høje tætheder af mesenkymale celler, navngivet oncostreams, korrelerer med tumor malignitet. Vi har udviklet en unik tilgang til at forstå de mekanismer, der ligger til grund for gliomas vækst og invasion. Her beskriver vi en omfattende protokol, der udnytter laser capture microdissection (LMD) og RNA sekventering til at analysere differentialmRNA udtryk for intra-tumorheterogene multicellulære strukturer (dvs. mesenkymale områder eller områder af tumor invasion). Denne metode opretholder god væv histologi og RNA integritet. Perfusion, frysning, indlejring, skæring og farvning blev optimeret til at bevare morfologi og opnå høj kvalitet laser mikrodissektion prøver. Resultaterne viser, at perfusion af gliombærende mus ved hjælp af 30% saccharose giver god morfologi og RNA-kvalitet. Desuden, farvning tumor sektioner med 4% Cresyl violet og 0,5% eosin resulterer i god nuklear og cellulære farvning, samtidig med at RNA integritet. Den beskrevne metode er følsom og meget reproducerbar, og det kan udnyttes til at studere tumor morfologi i forskellige tumor modeller. Sammenfattende beskriver vi en komplet metode til at udføre LMD, der bevarer morfologi og RNA-kvalitet til sekventering for at studere de molekylære træk ved heterogene flercellede strukturer inden for solide tumorer.
Introduction
Gliomer er de mest aggressive primære tumorer i centralnervesystemet. De er meget invasive og heterogene1. Analyse af cellulære og molekylære komponenter af tumoren vil afsløre nye terapeutiske mål.
Blandt forskellige metoder i øjeblikket til rådighed, laser capture microdissection (LMD) af frosne hjernetumor væv er en omkostningseffektiv, pålidelig teknik, der gør det muligt at isolation af diskrete anatomiske områder eller specifikke cellepopulationer fra tumorvæv til at studere deres molekylære profil2,3. LMD gør det muligt at analysere mRNA-genekspressionsprofiler for udvalgte enkeltceller eller flercellede strukturer4,5. LMD kan udnyttes til at få dybdegående mekanistisk viden om de molekylære begivenheder, der finder sted under tumorprogression. Forbedring i behandlingen af tumorvæv er nødvendig for at opnå optimal optisk opløsning af vævmorfologi og RNA-kvalitet6. Selvom paraformaldehydfiksering er den bedste løsning til morfologisk analyse, påvirkes RNA-kvaliteten og nedbrydes under disse forhold, hvilket resulterer i dårlig RNA-kvalitet til RNA-seq-analyse. Brugen af frosne vævssektioner undgår iskrystaldannelse, som kan bryde cellemembraner og producere huller i cellerne, og forbliver den bedste løsning for RNA-Seq-analyse7.
Her beskriver vi en optimeret sektion fiksering og farvning metode til at behandle frosne mus hjernetumor væv til LMD. For at forhindre iskrystaller i at danne i vævet, perfunderes vi mus med en opløsning på 30% saccharose. Denne løsning forstyrrer samspillet mellem polarvandmolekyler og forhindrer dannelsen af iskrystaller, bevare væv morfologi. Væv farvning er nødvendig for at differentiere og opnå specifikke population af celler eller anatomisk adskilte områder inden for tumoren. Det er vigtigt at fastsætte og plette vævet med uskadelige farvestoffer for at opretholde RNA-integritet. Det har tidligere været påvist, at farvningsvæv med hæmatoxylin/eosin (H&E) forringer RNA-integritet8. Vi fast og farves væv af interesse med ethanol, Cresyl violet 4% og eosin Y 0,5% opløsninger. Cresyl violet er en acidophilic farvestof, pletter cellekernen med en mørkeblå farve. Eosin Y er en basofile farvestof, pletter grundlæggende komponenter i cellerne, giver en sondring mellem cytoplasma og andre cellulære strukturer8. Begge farvestoffer er opløselige i ethanol og forringer ikke RNA-kvaliteten. For at undgå vævsskader og opretholde en høj optisk opløsning af de cellulære strukturer monterede vi vævssektionerne før LMD9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for gliom heterogenitet og invasion, er af afgørende betydning for at afdække nye terapeutiske mål13. I dette manuskript beskriver vi en detaljeret og optimeret metode til at analysere det molekylære landskab af gliom heterogenitet og invasion ved hjælp af laser capture microdissection (LMD) efterfulgt af transskriptionsanalyse.
Laser capture microdissection (LMD) kan bruges til at identificere forskell…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev støttet af National Institutes of Health, (NIH/NINDS) Tilskud: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 til M.G.C.; (NIH/NINDS) Tilskud R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 til P.R.L. (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; Institut for Neurokirurgi, Rogel Cancer Center ved University of Michigan, ChadTough Foundation, og Leah’s Happy Hearts Foundation til M.G.C. og P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 til M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) tilskud, Projekt F049768 til AC University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, en læge-Scientist Award fra Forskning for at forebygge blindhed, Inc. (RPB), tilskud R01 EY022633 fra NEI af NIH (AK), og en ubegrænset tilskud fra RPB til Institut for Oftalmologi og Visual Sciences. Denne forskning udnyttede Vision Research Core (P30 EY007003), og Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK er støttet af Mrs William Davidson Emerging Scholar Award fra A. Alfred Taubman Medical Research Institute.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
Referencias
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas – implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Rabien, A., Kristiansen, G. Tissue Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).
- Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection. Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).
- Núñez, F. J., et al. IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response. Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Brat, D. J., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing. Science. 358 (6359), 64-69 (2017).
- Gagner, J. P., Zagzag, D. Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).
