الليزر التقاط Microdissection من المناطق دون الإقليمية ديوموما للتوصيف المكاني والجزيئي للتغاير داخل الورم، Oncostreams، والغزو
Summary
الليزر المجهري (LMD) هو تقنية حساسة وقابلة للاستنساخ للغاية التي يمكن استخدامها للكشف عن المسارات التي تتوسط عدم تجانس الورم الدبقي والغزو. هنا، نحن نصف بروتوكول الأمثل لعزل المناطق المنفصلة من أنسجة الورم الدبقي باستخدام الليزر LMD تليها تحليل النسخ.
Abstract
الأورام الدبقية هي أورام الدماغ الأولية التي تتميز الغازية وعدم التجانس. أنماط النسيج محددة مثل pseudopalisades، وانتشار الأوعية الدموية الدقيقة، والتحول mesenchymal ونخر تميز عدم التجانس النسيجي من الأورام الدبقية عالية الجودة. وقد أثبت مختبرنا أن وجود كثافات عالية من الخلايا الميسنشيمال، واسمه oncostreams، يرتبط مع ورم خبيث. لقد طورنا نهجًا فريدًا لفهم الآليات التي يقوم عليها نمو الورم الدبقي وغزوه. هنا، نحن نصف بروتوكول شامل يستخدم الليزر التقاط microdissection (LMD) وتسلسل الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير mRNA التفاضلية من الهياكل متعددة الخلايا غير متجانسة داخل الورم (أي المناطق mesenchymal أو مناطق غزو الورم). تحافظ هذه الطريقة على أنسجة جيدة وسلامة الحمض النووي الريبي. تم تحسين التبرّق والتجميد والتضمين والأقسام وتلطيخ الخلايا للحفاظ على المورفولوجيا والحصول على عينات ميكرودية ليزر عالية الجودة. تشير النتائج إلى أن توبر الفئران التي تحمل الورم الدبقي باستخدام السكروز بنسبة 30٪ يوفر مورفولوجيا جيدة وجودة الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك، يؤدي تلطيخ أقسام الورم مع 4٪ كريسيلي بنفسجي و0.5٪ من الإيوسين إلى تلطيخ نووي وخلوي جيد، مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. الطريقة الموصوفة حساسة وقابلة للاستنساخ للغاية ويمكن استخدامها لدراسة مورفولوجيا الورم في نماذج الأورام المختلفة. باختصار، نحن نصف طريقة كاملة لأداء LMD التي تحافظ على مورفولوجيا وRNA الجودة لتسلسل لدراسة السمات الجزيئية للهياكل متعددة الخلايا غير متجانسة داخل الأورام الصلبة.
Introduction
الأورام الدبقية هي الأورام الأولية الأكثر عدوانية في الجهاز العصبي المركزي. فهي شديدة التوغل وغير متجانسة1. تحليل المكونات الخلوية والجزيئية للورم سوف تكشف عن أهداف علاجية جديدة.
من بين الطرق المختلفة المتاحة حاليا، ليزر التقاط microdissection (LMD) من أنسجة ورم الدماغ المجمدة هو تقنية فعالة من حيث التكلفة، موثوق بها التي تسمح لعزل المناطق التشريحية منفصلة أو مجموعات خلايا محددة من أنسجة الورم لدراسة ملفها الجزيئي2,,3. LMD يسمح بتحليل ملامح التعبير الجيني مرنا من خلايا واحدة مختارة أو هياكل متعددة الخلايا4,5. يمكن استخدام LMD لاكتساب معرفة ميكانيكية متعمقة حول الأحداث الجزيئية التي تحدث أثناء تطور الورم. تحسين في معالجة أنسجة الورم ضروري للحصول على الدقة البصرية المثلى لمورفولوجيا الأنسجة وRNA-الجودة6. على الرغم من أن تثبيت بارافورمالديهايد هو الخيار الأفضل للتحليل المورفولوجي ، تتأثر جودة الحمض النووي الريبي وتتدهور في ظل هذه الظروف ، مما يؤدي إلى ضعف جودة الحمض النووي الريبي لتحليل RNA-seq. استخدام أقسام الأنسجة المجمدة يتجنب تكوين الكريستال الجليد، والتي يمكن أن تكسر أغشية الخلايا وتنتج ثقوب داخل الخلايا، ويبقى الخيار الأفضل لتحليل الحمض النووي الريبي-Seq7.
هنا، ونحن نصف تثبيت قسم الأمثل وطريقة تلطيخ لمعالجة الأنسجة المجمدة ورم الدماغ الماوس لLMD. لمنع بلورات الثلج من تشكيل في الأنسجة، ونحن perpering الفئران مع حل من السكروز 30٪. هذا الحل يعطل التفاعلات بين جزيئات الماء القطبي ويمنع تشكيل بلورات الجليد، والحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة. تلطيخ الأنسجة ضروري للتمييز والحصول على مجموعة محددة من الخلايا أو مناطق متميزة تشريحيا داخل الورم. من الضروري إصلاح ووصمة عار الأنسجة مع الأصباغ حميدة للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. وقد ثبت سابقا أن تلطيخ الأنسجة مع الهيماتوكسيلين / إيوسين (H & E) يتدهور سلامة الحمض النووي الريبي8. قمنا بإصلاح وتلطيخ الأنسجة ذات الأهمية مع الإيثانول، كريسيلي البنفسجي 4٪ وإيوسين Y 0.5٪ حلول. كريسل البنفسجي هو صبغة حمضية تلطخ نواة الخلية بلون أزرق داكن. إيوسين Y هو صبغة بازوفيلية تلطخ المكونات الأساسية للخلايا ، مما يوفر التمييز بين السيتوبلازم والهياكل الخلوية الأخرى8. كلا الأصباغ قابلة للذوبان في الإيثانول ولا تتدهور نوعية الحمض النووي الريبي. لتجنب تلف الأنسجة والحفاظ على دقة بصرية عالية من الهياكل الخلوية ، قمنا بتركيب أقسام الأنسجة قبل LMD9.
Protocol
Representative Results
Discussion
فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء عدم تجانس الورم الدبقي والغزو ذات أهمية حاسمة للكشف عن الأهداف العلاجية الجديدة13. في هذه المخطوطة، نصف طريقة مفصلة ومحسنة لتحليل المشهد الجزيئي لعدم تجانس الورم الدبقي والغزو باستخدام المجهر التقاط الليزر (LMD) يليه تحليل النسخ.
<p class="jove_conte…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ودعمت المنح التي تقدمها المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة/المعهد الوطني للصحة): R37-NS094804، R01-NS105556، R21-NS107894 إلى M.G.C.؛ (المعاهد القومية الوطنية للصحة / NINDS) المنح R01-NS076991، R01-NS096756، R01-NS082311 إلى P.R.L.; (المعاهد القومية الوطنية للصحة/المعهد الوطني للبناء القومي): R01-EB022563؛ (المعاهد القومية للصحة/NCI) U01CA224160; قسم جراحة الأعصاب، مركز روجل للسرطان في جامعة ميشيغان، مؤسسة تشادترو، ومؤسسة ليا قلوب سعيدة إلى M.G.C. و P.R.L. الحمض النووي الريبي منحة الطب الحيوي F046166 إلى المعاهد الوطنية للصحة M.G.C. ، UL1 TR002240 لمعهد ميشيغان للبحوث السريرية والصحية (MICHR)، بعد الدكتوراه برنامج علماء الترجمة (PTSP) منحة، مشروع F049768 إلى جامعة ميشيغان فوربس معهد أبحاث السرطان، وجائزة الطبيب والعالم من البحوث لمنع العمى، وشركة (RPB)، منحة R01 EY022633 من NEI من المعاهد القومية للصحة (AK)، ومنحة غير مقيدة من RPB إلى قسم طب العيون والعلوم البصرية. استخدم هذا البحث نواة أبحاث الرؤية (P30 EY007003) ، ونواة أبحاث مركز السرطان (P30 CA046592). ويدعم AK من قبل السيدة وليام ديفيدسون جائزة الباحث الناشئة من معهد أ. ألفريد تاوبمان للبحوث الطبية.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
Referencias
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas – implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Rabien, A., Kristiansen, G. Tissue Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).
- Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection. Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).
- Núñez, F. J., et al. IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response. Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Brat, D. J., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing. Science. 358 (6359), 64-69 (2017).
- Gagner, J. P., Zagzag, D. Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).
