Лазерная захват микродиссекция субрегионов глиомы для пространственной и молекулярной характеристики внутриопухолевой гетерогени, онкостримов и вторжения
Summary
Лазерная микродиссекция (LMD) является чувствительным и высоко воспроизводимым методом, который может быть использован для выявления путей, которые посредничают неоднородность глиомы и вторжения. Здесь мы описываем оптимизированный протокол для изоляции дискретных областей от глиомной ткани с помощью лазерного LMD с последующим транскриптомическим анализом.
Abstract
Глиомы являются первичными опухолями головного мозга, характеризующимся их инвазивностью и неоднородностью. Специфические гистологические модели, такие как псевдопализады, микрососудистая пролиферация, мезенхимальная трансформация и некроз характеризуют гистологическую неоднородность полноценных глиом. Наша лаборатория показала, что наличие высокой плотности мезенхимальных клеток, названных онкостримами, коррелирует со злокачественностью опухоли. Мы разработали уникальный подход к пониманию механизмов, лежащих в основе роста и вторжения глиомы. Здесь мы описываем всеобъемлющий протокол, который использует лазерный захват микродиссекции (LMD) и секвенирования РНК для анализа дифференциального мРНК выражение внутриопухолевых неоднородных многоклеточных структур (т.е. мезенхимальных областей или областей вторжения опухоли). Этот метод поддерживает хорошую гистологию тканей и целостность РНК. Перфузия, замораживание, встраивание, секционирование и окрашивание были оптимизированы для сохранения морфологии и получения высококачественных образцов лазерной микродиссекции. Результаты показывают, что перфузия глиомы подшипников мышей с использованием 30% сахарозы обеспечивает хорошее морфологии и качества РНК. Кроме того, окрашивание опухолевых секций с 4% Cresyl фиолетовый и 0,5% эозин приводит к хорошему ядерному и клеточному окрашиванию, сохраняя при этом целостность РНК. Описанный метод является чувствительным и высоко воспроизводимым и может быть использован для изучения морфологии опухоли в различных моделях опухолей. Таким образом, мы описываем полный метод для выполнения LMD, который сохраняет морфологию и качество РНК для секвенирования для изучения молекулярных особенностей неоднородных многоклеточных структур в твердых опухолях.
Introduction
Глиомы являются наиболее агрессивными первичными опухолями центральной нервной системы. Они очень инвазивные и неоднородные1. Анализ клеточных и молекулярных компонентов опухоли выявит новые терапевтические цели.
Среди различных методов в настоящее время доступны, лазерный захват микродиссекции (LMD) замороженных тканей опухоли головного мозга является экономически эффективным, надежным методом, который позволяет изоляции отдельных анатомических областях или конкретных популяций клеток из опухолевых тканей для изучения их молекулярного профиля2,3. LMD позволяет анализанализ мРНК генэкспрессии профилей отдельных клеток или многоклеточных структур4,5. LMD может быть использован для получения углубленных механических знаний о молекулярных событиях, которые происходят во время прогрессирования опухоли. Улучшение обработки опухолевых тканей необходимо для получения оптимального оптического разрешения морфологии тканей и РНК-качества6. Хотя параформальдегид фиксации является лучшим вариантом для морфологического анализа, качество РНК влияет и ухудшается в этих условиях, в результате чего плохое качество РНК для анализа РНК-сек. Использование замороженных секций ткани позволяет избежать образования кристалла льда, которые могут сломать клеточные мембраны и производить отверстия в клетках, и остается лучшим вариантом для анализа РНК-Seq7.
Здесь мы описываем оптимизированный метод фиксации секции и окрашивания для обработки замороженных тканей опухоли мозга мыши для LMD. Чтобы предотвратить образование кристаллов льда в тканях, мы проникнуты мышам раствором 30% сахарозы. Это решение нарушает взаимодействие между молекулами полярной воды и предотвращает образование кристаллов льда, сохраняя морфологию тканей. Ткань окрашивания необходимо дифференцировать и получить конкретные популяции клеток или анатомически различных областях в опухоли. Важно, чтобы исправить и испачкать ткани безобидными красителей для поддержания целостности РНК. Ранее было показано, что окрашивание ткани гематоксилин / эозин (H и E) ухудшает целостность РНК8. Мы зафиксировали и запятнали ткани интереса с этанолом, cresyl фиолетовым 4% и eosin Y 0.5% разрешениями. Кресил фиолетовый является ацидофильные красителя, который пятна ядра клетки с темно-синим цветом. Eosin Y является базофильной красителя, который пятна основных компонентов клеток, обеспечивая различие между цитоплазмы и других клеточных структур8. Оба красителей растворяются в этаноле и не ухудшают качество РНК. Чтобы избежать повреждения тканей и поддерживать высокое оптическое разрешение клеточных структур, мы смонтировали секции тканей до LMD9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе неоднородности глиомы и вторжения имеют решающее значение для выявления новых терапевтических целей13. В этой рукописи мы описываем подробный и оптимизированный метод анализа молекулярного ландшафта неоднородности гл?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения ( NIH/NINDS) Гранты: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 до M.G.C.; (NIH/NINDS) Гранты R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 до P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; Кафедра нейрохирургии, онкологический центр Рогела в Мичиганском университете, Фонд Чада Tough и Фонд «Счастливые сердца» Лии для M.G.C. и P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 для M.G.C. Национальные институты здравоохранения, UL1 TR002240 для Мичиганского института клинических и медицинских исследований (MICHR), Postdoctoral Translation Проект F049768 в Университет е.С. Мичиганский институт исследований рака Forbes, Врач-ученый премии от исследований по предотвращению слепоты, Inc (RPB), грант R01 EY022633 от NEI NIH (AK), и неограниченный грант от RPB на кафедру офтальмологии и визуальных наук. В этом исследовании использовались Научно-исследовательское ядро зрения (P30 EY007003) и Научно-исследовательское ядро онкологического центра (P30 CA046592). АК поддерживается г-жой Уильям Дэвидсон Emerging Scholar Award от Медицинского научно-исследовательского института имени А. Альфреда Таубмана.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
Referencias
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas – implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Rabien, A., Kristiansen, G. Tissue Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).
- Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection. Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).
- Núñez, F. J., et al. IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response. Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Brat, D. J., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing. Science. 358 (6359), 64-69 (2017).
- Gagner, J. P., Zagzag, D. Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).
