इंटेरामोरल विषमता, ओंकोस्ट्रीम और आक्रमण के स्थानिक और आणविक लक्षण वर्णन के लिए ग्लियोमा उपक्षेत्रों का लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन
Summary
लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) एक संवेदनशील और अत्यधिक प्रजनन योग्य तकनीक है जिसका उपयोग ग्लियोमा विषमता और आक्रमण में मध्यस्थता करने वाले रास्तों को उजागर करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम ट्रांसपोमिक विश्लेषण के बाद लेजर एलएमडी का उपयोग करके ग्लियोमा ऊतक से असतत क्षेत्रों को अलग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
ग्लियोमास प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर हैं जो उनकी आक्रामकता और विषमता की विशेषता है। विशिष्ट हिस्टोलॉजिकल पैटर्न जैसे छद्मपालीसेड्स, माइक्रोवैस्कुलर प्रसार, मेसेंचिमल परिवर्तन और परिगलन उच्च ग्रेड ग्लियोमा की हिस्टोलॉजिकल विषमता की विशेषता है। हमारी प्रयोगशाला ने दिखा दिया है कि ऑनकोस्ट्रीम नाम की मेसेनचिमल कोशिकाओं के उच्च घनत्व की उपस्थिति ट्यूमर द्रोह से सहसंबंधित है। हमने ग्लियोमा के विकास और आक्रमण को रेखांकित करने वाले तंत्रों को समझने के लिए एक अनूठा दृष्टिकोण विकसित किया है । यहां, हम एक व्यापक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) और आरएनए अनुक्रमण का उपयोग अंतर-ट्यूमर विषम बहुकोशिकीय संरचनाओं (यानी, मेसेंचिमल क्षेत्रों या ट्यूमर आक्रमण के क्षेत्रों) की अंतर mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए करता है। यह विधि अच्छे ऊतक हिटोलॉजी और आरएनए अखंडता को बनाए रखता है। परफ्यूजन, ठंड, एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और धुंधला को आकृति विज्ञान को संरक्षित करने और उच्च गुणवत्ता वाले लेजर माइक्रोडिसेक्शन नमूने प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था। परिणामों से संकेत मिलता है कि 30% सुक्रोज का उपयोग करके ग्लियोमा असर चूहों का परफ्यूजन अच्छी आकृति विज्ञान और आरएनए गुणवत्ता प्रदान करता है। इसके अलावा, आरएनए अखंडता को संरक्षित करते समय, 4% क्रेसिल वायलेट और 0.5% eosin के साथ ट्यूमर वर्गों को धुंधला करना अच्छा परमाणु और सेलुलर धुंधला होता है। वर्णित विधि संवेदनशील और अत्यधिक प्रजनन योग्य है और इसका उपयोग विभिन्न ट्यूमर मॉडलों में ट्यूमर आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। संक्षेप में, हम एलएमडी करने के लिए एक पूर्ण विधि का वर्णन करते हैं जो ठोस ट्यूमर के भीतर विषम बहुकोशिकीय संरचनाओं की आणविक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए अनुक्रमण के लिए आकृति विज्ञान और आरएनए गुणवत्ता को बरकरार रखता है।
Introduction
ग्लियोमास केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के सबसे आक्रामक प्राथमिक ट्यूमर हैं। वे अत्यधिक आक्रामक और विषम1हैं । ट्यूमर के सेलुलर और आणविक घटकों का विश्लेषण उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों को प्रकट करेगा।
वर्तमान में उपलब्ध विभिन्न तरीकों में, जमे हुए ब्रेन ट्यूमर ऊतक के लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) एक लागत प्रभावी, विश्वसनीय तकनीक है जो ट्यूमर ऊतकों से असतत शारीरिक क्षेत्रों या विशिष्ट कोशिका आबादी के अलगाव को उनके आणविक प्रोफ़ाइल2,,3का अध्ययन करने की अनुमति देती है। एलएमडी चयनित एकल कोशिकाओं या बहुकोशिकीय संरचनाओं4,5के एमआरएनए जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के विश्लेषण की अनुमति देता है । एलएमडी का उपयोग ट्यूमर प्रगति के दौरान होने वाली आणविक घटनाओं के बारे में गहराई से यंत्रवादी ज्ञान प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। ऊतक आकृति विज्ञान और आरएनए-गुणवत्ता6के इष्टतम ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए ट्यूमर ऊतकों के प्रसंस्करण में सुधार आवश्यक है। यद्यपि पैराफॉर्मलडिहाइड निर्धारण रूपात्मक विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा विकल्प है, इन शर्तों के तहत आरएनए गुणवत्ता प्रभावित और अपमानित होती है, जिसके परिणामस्वरूप आरएनए-सीक्यू विश्लेषण के लिए खराब आरएनए गुणवत्ता होती है। जमे हुए ऊतक वर्गों का उपयोग बर्फ क्रिस्टल गठन से बचा जाता है, जो कोशिका झिल्ली को तोड़ सकता है और कोशिकाओं के भीतर छेद का उत्पादन कर सकता है, और आरएनए-एसईक्यू विश्लेषण7के लिए सबसे अच्छा विकल्प बना हुआ है।
यहां, हम एलएमडी के लिए जमे हुए माउस ब्रेन ट्यूमर ऊतकों को संसाधित करने के लिए एक अनुकूलित अनुभाग निर्धारण और धुंधला विधि का वर्णन करते हैं। ऊतक में बनाने से बर्फ क्रिस्टल को रोकने के लिए, हम 30% सुक्रोज के समाधान के साथ चूहों को व्याप्त करते हैं। यह समाधान ध्रुवीय पानी के अणुओं के बीच बातचीत को बाधित करता है और ऊतक आकृति विज्ञान को संरक्षित करते हुए बर्फ क्रिस्टल के गठन को रोकता है। ट्यूमर के भीतर कोशिकाओं या शारीरिक रूप से विशिष्ट क्षेत्रों की विशिष्ट आबादी को अलग करने और प्राप्त करने के लिए ऊतक धुंधला करना आवश्यक है। आरएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए ऊतक को अहानिकर रंगों से ठीक करना और दाग देना आवश्यक है। यह पहले दिखाया गया है कि हेमेटक्सीलिन/eosin (एच & ई) के साथ धुंधला ऊतक आरएनए अखंडता8बिगड़ती है । हमने इथेनॉल, क्रेसिल वायलेट 4% और eosin Y 0.5% समाधानों के साथ ब्याज के ऊतकों को ठीक और दाग दिया। क्रेसिल वायलेट एक एसिडोफिलिक डाई है जो कोशिका नाभिक को गहरे नीले रंग से दाग देता है। Eosin Y एक basophilic रंग है जो कोशिकाओं के बुनियादी घटकों को दाग देता है, जो साइटोप्लाज्म और अन्य सेलुलर संरचनाओं8के बीच अंतर प्रदान करता है। दोनों रंग इथेनॉल में घुलनशील हैं और आरएनए गुणवत्ता को खराब नहीं करते हैं। ऊतक क्षति से बचने और सेलुलर संरचनाओं के उच्च ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन को बनाए रखने के लिए, हमने एलएमडी9से पहले ऊतक वर्गों पर मुहिम शुरू की।
Protocol
Representative Results
Discussion
ग्लियोमा विषमता और आक्रमण अंतर्निहित आणविक तंत्रों को समझना उपन्यास चिकित्सीयलक्ष्यों कोउजागर करने के लिए महत्वपूर्ण महत्व पूर्ण है । इस पांडुलिपि में, हम लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एल?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों( NIH/NINDS) अनुदान: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 से M.G.C. द्वारा समर्थित किया गया था; (NIH/NINDs) अनुदान R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 को P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (एनआईएच/एनसीआई) U01CA224160; न्यूरोसर्जरी विभाग, मिशिगन विश्वविद्यालय में रोगेल कैंसर केंद्र, चैडकड़ा फाउंडेशन, और लिआ के हैप्पी हार्ट्स फाउंडेशन को एमजीसी और पी.आर.एल. आरएनए बायोमेडिसिन ग्रांट F046166 को एमजीसी नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ, UL1 TR002240 मिशिगन इंस्टीट्यूट फॉर क्लीनिकल एंड हेल्थ रिसर्च (MICHR), पोस्टडॉक्टोरल ट्रांसलेशनल स्कॉलर्स प्रोग्राम (पीटीएसपी) अनुदान, पोस्टडॉक्टोरल ट्रांसलेशनल स्कॉलर्स प्रोग्राम (पीटीएसपी) अनुदान, परियोजना F049768 मिशिगन फोर्ब्स कैंसर अनुसंधान संस्थान के ईसा पूर्व विश्वविद्यालय के लिए, एक चिकित्सक-अनुसंधान से वैज्ञानिक पुरस्कार अंधापन को रोकने के लिए, इंक (RPB), एनआईएच (एके) के NEI से अनुदान R01 EY022633, और आरपीबी से नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान विभाग के लिए एक अप्रतिबंधित अनुदान । इस शोध ने विजन रिसर्च कोर (P30 EY007003), और कैंसर सेंटर रिसर्च कोर (P30 CA046592) का उपयोग किया। एके को ए अल्फ्रेड तौबमैन मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट से मिसेज विलियम डेविडसन इमर्जिंग स्कॉलर अवॉर्ड का समर्थन प्राप्त है ।
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
Referencias
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