雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

すべての動物の使用と取り扱いの慣行は、ラトガース大学の内部動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。 1. マウスの繁殖 雌マウスホモ接マウスは、Stra8-iCre対立遺伝子(B6)のオスに対するトリオ交配における男性不妊症(本明細書中の目的の遺伝子と呼ばれる)を男性不妊症に導くRNA結合タンパク質突然変異に対するホモ接マウスを有する。FVB-Tg(Stra8-iCre)1Reb /LguJ) (Cre+) は、2匹のメスをすべての雄に対して組み合わせることで繁殖効率が向上します。注:Mの雌のホモ接合は正常な生殖能力を有するので、目的の変異遺伝子(M)は母親に渡された。これは、オスの生殖細胞Cre(ヘミジゴス)の父方の伝染を可能にし、推奨される21と目的のアレリック組み合わせで子孫の割合を最適化するという付加的な利点を有する。ホモ接合性Cresは生殖細胞毒性22を示すので、アレレをヘテロ接合またはヘミジゴス状態で維持し、通過することが推奨される。重要なことに、Cre発現は実験集団までRpl22-HAアレレと共生してはならない。繁殖動物のCreからRpl22-HAアレレを分離しないと、生殖細胞Cre活性のためにRpl22-HAを世界的に発現する子孫が生じる。この問題は、胚細胞に固有のものです。さらに、Stra8-iCreは、プレレプトテンとレプトテンを含むミオシスに移行し、非常に早い段階で移行する細胞を標的とする、関心のある22の著者の細胞集団に特有である。別の種類のセルに固有の別のCreドライバを代わりに使用できます。一般的な習慣は、男性の生殖細胞発現Cresが父方側に伝達されることを指示する。しかし、Stra8-iCreの母親の伝達は、男性の子孫で同様の経遺伝子発現をもたらす可能性がある。選択された繁殖スキームに関係なく、同等のCre発現を持つ子孫を生成するために、すべての実験サンプルは、同じ親側(常に母親または常に父方)からCre伝達を介して生成されるべきである。 セクション2.4で説明したように、遺伝子型結果の雄の子犬。下流の繁殖のためにCre(+/M:Cre+)のためにMアレレと陽性を運ぶものを選択してください。 Rpl22-HAのオスホモ接合におけるMアレに雌マウスホモ接合を繁殖させる(B6J.129(Cg)-Rpl22tm1.1Psam/SjJ)。注: Rpl22-HAのバックグラウンドは非常に混合されているので、歪み特異的な表型を評価する際には注意が必要です。 遺伝子型は、Mアレを運ぶものを識別するために、女性の子犬を生成し、Rpl22-HA(+/M:Rpl22-HA+)のために陽性(セクション2.3を参照)。下流の繁殖のためにこれらのメスを選択してください。 クロス+/M:トリオの交配で+/M:Rpl22+女性とクレ+男性。結果として得られる子犬を遺伝子入力し(セクション2.3および2.4を参照)、Cre+とRpl22+の両方の雄と野生型またはM/Mの両方である男性を識別する。注:この研究は、完全な男性不妊症をもたらす突然変異に焦点を当てているので、最も効率的に所望の実験的遺伝子型を得るために繁殖スキームに特別な考慮事項が取られています。このような検討事項は、他の実験モデルでは不要である可能性があります。繁殖に関する考慮事項の詳細については、図 2で完全な繁殖の概略図とそれに付随する凡例を参照してください。 2. サンプル収集 産後21日(dpp)で雄のマウスから精巣を収集します。 CO2吸入によるマウスの犠牲、その後に頸部脱臼を行う。両側切開部を2つの短い(それぞれ2cm)で横たわる各動物に腹側切開(3cm)し、横切りを接続する。精巣を明らかにするために皮膚と腹皮を引き戻します。 鉗子を使用して、体腔の片側からエピジマル脂肪パッドを引っ張って、精巣上体および精巣を明らかにする。テノトミーはさみで、精巣を切除し、精巣上体、周囲の脂肪、および任意の外部血管系を取り除くために注意してください。無傷の精巣を清潔な1.7 mLチューブに入れます。 反対側で繰り返し、第1のチューブに2番目の精巣を加えます。このチューブをキャップし、すぐにフラッシュ凍結する液体窒素に沈めます。注:サンプルは使用まで-80 °Cで保存することができます。 ジェノタイピング確認のために、各動物(2mm)の追加のテールチップサンプルを収集します。 DNAを抽出するには、1.7 mLチューブの2mmテールチップに50mM NaOHの100μLを加え、95°Cで30分間沸騰させ、50mM HClの100μLと1MトリスHCl pH 8.0の20μLと10,00xgで3分間の遠心分離サンプルを加えます。上清(ゲノムDNAを含む)を保持し、抽出したDNAを以下のジェノタイピング反応のテンプレートとして使用するまで4°Cで保存する。 次のプライマーを使用してSanzら13から適応した方法に従ってRpl22-HAジェノタイピングを行う:5′ GGGAGGCTGcTGGATG 3′;逆: 5′ TTCcAGACACAAGTACAC 3′. ステップ2.2.1で抽出した2μLのDNAからなる反応混合物を調製し、25mM dNTPsの0.08 μL、10mMフォワードプライマーの0.1μL、10mMフォワードプライマー、 0.1 μL の 10 mM リバースプライマー、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) バッファーの 2 μL (650 mM トリス pH = 8.8、165 mM (NH 4)2SO 4、30 mM MgCl 2、0.1% Tween)、0.2 μL のタクサーゼの 0.2 μL、および核無 2 0 0 0 00 μL の合計 O0 μL に対して合計 20 μL のポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) バッファー (165 mM (NH4)2 SO4)、 0.1% Tween ) 、タクラーゼの 0.2 μL、および核無 2 0 0 0 0 00 00 00 00 00 00 000 000 00 000 0000 95°Cで30sプライマー融解ステップ、64°Cで30sのアニール、72°Cで30s伸長を用い、72°Cで最終5分伸びで37回繰り返した。注: これは、野生型サンプルの場合は 260 bp、Rpl22-HA+のサンプルの場合は 292 bp の製品サイズを生み出しました。 次のプライマーを使用してクレ・ジェノタイピングを実行する:フォワード:5’GTGCCAGCTGAACAACAGGA 3′;逆: 5′ アガカカガキャットガGTC 3′.代わりに、Creプライマーを利用してステップ2.3.2で説明したPCR反応を準備する。95°Cで30sプライマー融解ステップ、60°Cで30sのアニール、72°Cで15sの伸びを用い、72°Cで最終5分の伸びで35回繰り返した。 対象遺伝子の標準として目的遺伝子の遺伝子を実行します。注 : 著者のジェノタイピング プロトコルは、集中型カスタムTaqを使用するため、他のユーザーは、そのユーザーの必要条件に合わせて条件を変更する必要があります。この関心喪失の遺伝子が翻訳に及ぼす影響をよりよく理解するために、対象の変異対立遺伝子に対して野生型またはホモ接合体のいずれかであり、Cre+およびRpl22+も実験サンプルとして選択された。遺伝子型の選択は、セクション1で上で更に論じられます。 3. ソリューションの準備 注: ソリューションの準備と以降のすべての手順は、厳しい条件下で行う必要があります。 均質化バッファー(HB)を調製するには、1 M トリス pH 7.4 の 2.5 mL、1 M KCl の 5 mL、1 M MgCl2の 600 μL、50 mL の NP-40 の 500 μL を追加します。ジエチルパイロカーボネート(DEPC)H2 Oで体積(50mL)に持ち込み、すべての成分が組み込まれるまで混合します。注:最終濃度は、50 mM トリス pH 7.4、100 mM KCl、12 mM MgCl2、および 1% NP-40 です。 高塩洗浄バッファー(HSWB)を調製するには、1 M トリス pH 7.4 の 2.5 mL、1 M KCl の 15 mL、1 M MgCl2の 600 μL、50 mL の NP-40 の 500 μL を 50 mL チューブに追加します。DEPC H2Oで体積(50 mL)に持ち込み、すべての成分が組み込まれるまで混合します。注:最終濃度は、以下のようになります:50 mMトリスpH 7.4、300 mM KCl、12 mM MgCl2、および1%NP-40プロトコルはここで一時停止することができ、溶液は使用まで室温で保存することができます。 4. 組織の調製 すべてのサンプルチューブを事前に重くし、重量を記録し、液体窒素でプレクールします。 プレクール無菌モルタル、害虫、およびドライアイス上のヘラの重量を量る。 フラッシュ凍結組織サンプルを、ドライアイス上のプレクール、無菌モルタル、害虫を使用して微粉に粉砕します。 フラッシュ凍結組織をドライアイスのプレクールモルタルに入れます。害虫を使って組織を細かく割り、組織が微細な粉末になるまでゆっくりと粉砕します。注:新鮮な組織も使用することができますが、元のプロトコル13に従って、フラッシュ凍結組織の使用で結果に有意な差は認められない。詳細については、「代表的な結果と議論」を参照してください。 プレクールヘラを使用してモルタルから粉末を掻き取ることによって、粉砕したサンプルをプレクールの収集管に慎重に移します。組織のみが収集され、冷たいモルタルに堆積した水分がないことを確認してください。 可能な限りドライアイスに保つように注意して、組織とチューブを計量します。サンプルを含むチューブの重量からチューブの初期重量を減算して組織の質量を計算します。この値を記録して、後でリシスバッファボリュームを計算します。注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルは使用まで-80°Cで保存することができます。 5. サンプルの均質化 1Mジチオトレイトール(DTT)の10μL、1本のプロテアーゼ阻害剤錠、RNase阻害剤50μL(40,000単位/mL)、200μLの200μLの5mg/mLシクロヘキシミド、100μLの100mg/mLを100mg/mlのHBL100mg/mlを加えて、100μLの100mg/mLを調製する。すべてのコンポーネントが組み込まれるまで混ぜ、使用するまで氷の上に保管してください。注: 10 mL HB のサプリメントの最終濃度は次のようになります: 1 mM DTT、 200 U/mL RNase 阻害剤、100 μg/mL シクロヘキシミド、および 1 mg/mL ヘパリン。この溶液は、サプリメントの添加の24時間以内に使用する必要があり、使用まで4°Cまたは氷の上に保つことができます。 100 mg のサンプルごとに、1 mL のリシス バッファーを追加します。同じピペットを使用して、リシスバッファーを追加し、慎重に結果として得られるライセートを上下にフラグメント細胞にピペットし、混合する。サンプルが粘性でなくなるまでピケットを続けます(通常は25-30ストローク)。注:ソリューションは最初は非常に粘性があるため、大口径ピペットを使用して溶液を混合する必要があります。標準の1000μLは、通常、100mgの組織に対して十分です。 氷の上にサンプルを10分間セットして、リスにします。次いで、予冷遠心分離機(4°C)で10,000 x gで10分間スピンサンプルを。大きく、緩く、曇ったペレットは、チューブの底部に形成する必要があります。 ペレットを乱さないよう注意して、各サンプルの新しいチューブと記録体積にライセートを収集します。サンプルのデグレデータを防ぐために、サンプルが残りのプロトコル全体で冷たく保たれるようにし、可能な限り氷上または4°Cで保存してください。 6. ビーズの平衡化 ステップ5.2からのライセートの体積を用いて、適切な抗体結合タンパク質(この場合はタンパク質G)に結合した磁気ビーズの必要量を計算する。1 mL のライセートの場合は、375 μL のタンパク質 G ビーズ (30 mg/mL) を使用します。注:コンジュゲートビーズの選択は、使用される抗HA抗体によって異なります。例えば、ウサギ生成抗HA抗体が選択される場合、タンパク質Aビーズが好ましいであろう。 磁気チューブラックを使用して、ビーズの溶媒を取り出し、ビーズに同じ量の新鮮な溶解バッファーを加えます。4 °Cで5分回転して洗います。20 rpmに設定されたベンチトップチューブ回転器を使用して、すべての回転ステップを実行します。 磁気チューブラックにチューブを置き、洗浄バッファーを取り外します。 手順 6.1-6.3 をさらに 2 回繰り返します。 元のボリュームにライシスバッファーを加え、平衡ビーズを使用します。使用するまで4°Cまたは氷の上に保管してください。 7. プリクリアリングサンプル 1 mL のライセートごとに 50 μL の平衡ビーズを加え、ライセートサンプルの上清 (ライセート) に加え、4 °Cで 1 時間回転させます。 マグネットラックにチューブを置き、新鮮なチューブにライセートを収集します。使用済みビーズを捨てます。 ライセートに1 mLごとに25 μLの平衡ビーズを加え、4°Cで1時間回転させます。 マグネットラックにチューブを置き、新鮮なチューブにライセートを収集します。使用済みビーズを捨てます。クリアされたライセートから、50 μLを保持してサンプル入力制御として機能します。80 °Cで保管してください。注:入力サンプルは、組織の他の細胞タイプに関連するRNAを含むサンプルの総RNA集団を表すコントロールとして機能し、下流の分析中に遺伝子発現の変化を突然変異の関数として補正するために使用されます。 8. 抗体のインキュベーション 1 mLのクリアライセートごとに、抗HA抗体を5μg添加する。サンプルの損失を防ぐために、実験室のフィルムでチューブキャップを密封します。サンプルを4°Cで16-18時間回転させます。注:抗体インキュベーション時間と濃度は最適化されていません。著者らは、5 μgで一晩のインキュベーションで十分であることを発見した。しかし、インキュベーションが短いか、抗体が少ない場合には十分である可能性がある、あるいはより長いインキュベーションまたはより抗体が結合を改善する。 9. ビーズのインキュベーション 1 mLのクリアライセートごとに、300 μLのタンパク質Gビーズを加えます。試験用フィルムでチューブキャップを再シールし、4°Cで2時間回転させます。 10. ビーズの洗浄 サンプルチューブをマグネットラックに置き、ビーズをIPedライセートから分離できるようにします。ピペットは、ビーズを保持し、フロースルーライセートをオフにして廃棄します。 ビーズにHSWBの800 μLを適用し、4°Cで10分間回転させます。サンプルチューブをマグネットラックに置き、ビーズを洗浄から分離します。洗い物を取り出して捨てます。 ビーズにHSWBの別の800 μLを適用します。サンプルを閉じ、4°Cで5分間回転させます。サンプルチューブをマグネットラックに置き、ビーズを洗浄から分離します。洗い物を取り出して捨てます。 手順 10.3 をもう一度繰り返します。 11. RNA抽出 サンプルチューブをマグネットラックに置き、ビーズを洗浄から分離します。ピペットオフと廃棄洗浄、RNA抽出のためのビーズを保持します。ビーズに3.5 μLのβ-メルカプトエタノール(bME)を加え、15sの渦を混合します。 市販のRNA精製キットを用いてRNAを抽出します。RNaseフリーH2Oの30 μLの溶出サンプル。メモ:10 μL/サンプルDNase処理は、ほとんどのキットではオプションですが、強くお勧めします。このオプションのクリーンアップステップにより、バックグラウンドが大幅に減少し、より正確な最終濃度が得られます。リシスバッファーにβ-メルカプトエタノール(bME)を含むキットを使用することは強く再確認される。bMEはRNA分離中のサンプル分解を防ぐために、追加のRNase阻害剤として機能します。 サンプルを-80°Cに保存するか、すぐに分析してください。 12. 定量とサンプル分析 UV-Vis分光光度計を使用して、RNA濃度と予備品質を定量化します。 バイオアナライザーを介してサンプルから抽出したRNAの品質を分析します。注: その後、得られた RNA は、RNA シーケンシングや、ノーザン ブロッティング PCR や定量的逆転写 PCR (qRT-PCR) などのダウンストリーム解析に使用できます。