Metal-begrenset vekst av Neisseria gonoré for karakterisering av metall-responsive gener og metall oppkjøp fra Host Ligands

Neisseria gonoré forårsaker den vanlige seksuelt overførbare infeksjonen gonoré. Under infeksjon uttrykker patogenne neisseria et repertoar av metallresponsive gener som gjør at bakteriene kan overvinne metallbegrensningsarbeidet til den menneskelige verten^1,2,3. Spormetaller som jern og sink spiller sentrale roller i mange cellulære prosesser, for eksempel binding til enzymer i katalytiske steder, deltakelse i redoksreaksjoner og som strukturelle faktorer i ulike proteiner^4,5. Under metallbegrensede forhold er metallresponsive loci derepressed og deres resulterende proteiner kan hjelpe oppkjøpet av disse næringsstoffene. Karakterisering av disse genene og proteinene presenterer en unik teknisk utfordring for etterforskeren. Metallioner må holdes tilbake fra bakterier for å indusere transkripsjon av disse genene fra deres innfødte loci, men effektiv chelation av disse ionene fra metallbelastede medier kan være vanskelig å optimalisere. De forskjellige metallprofiler av kildevann og iboende lot-to-lot variasjon⁶ av pulveriserte ingredienser betyr at mengden chelator som kreves for å fjerne et bestemt metall fra et rikt medium vil variere mellom ulike steder, ingrediensleverandører, og selv over tid i et enkelt laboratorium som kjemisk inventar erstattes.

For å omgå denne utfordringen beskriver vi utarbeidelsen av et definert medium som behandles med Chelex-100 harpiks under forberedelse for å fjerne spormetaller fra løsningen. Dette mediet er tilstrekkelig næringstett for å tillate vekst av gonokokker, noe som er vanskelig å kultur utenfor den menneskelige verten, og gjør det mulig for etterforskeren å innføre en bestemt metallprofil ved å legge til sine egne definerte kilder og konsentrasjoner av Metaller. Metoden for kontrollert add-back av ønskede metaller til utarmet medium øker eksperimentell konsistens og gir mulighet for robuste, replikerbare eksperimenter uavhengig av faktorer som vannkilde og kjemiske partitall. Videre kan dette mediet distribueres som enten en væske eller fast med bare mindre modifikasjoner, noe som gjør det ganske allsidig.

For å demonstrere nytten av dette mediet, skisserer vi en protokoll for bruk for gonokokkvekst og beskriver tre vellykkede eksperimenter for å karakterisere metallresponsive Neisseria gener. For det første forbereder vi gonokokkhelcellelysates fra metallutarmede eller supplerte kulturer og viser variable nivåer av proteinproduksjon fra metallresponsiv loci. Vi skisserer deretter en sinkbegrenset vekstanalyse der gonokokkvekst styres av tilskudd av spesifikke, brukbare sinkkilder. Til slutt viser vi bindende analyser som viser hele gonokokkceller som uttrykker metallresponsive overflatereseptorer som binder seg til sine respektive metallholdige ligander. Vellykket overflatepresentasjon av disse reseptorene krever vekst i metallutarmet medium.

Den nåværende protokollen ble optimalisert spesielt for Neisseria gonoré, men mange andre bakterielle patogener bruker metalloppkjøpsstrategier under infeksjon⁷, så denne protokollen kan tilpasses for studiet av metall homeostase hos andre bakterier. Optimalisering av disse mediene og disse eksperimentelle protokollene for bruk hos andre bakterier vil sannsynligvis kreve liten endring av metallchelatorkonsentrasjoner og/eller behandlingstid med Chelex-100, da andre bakterier kan ha litt forskjellige metallkrav enn gonokokker. Jern og sink er de primære metallene av bekymring for de beskrevne undersøkelsene, men andre metaller (f.eks. mangan) har blitt demonstrert som kritiske for bakterier, inkludert Neisseria^8,9,10,11,12. Videre har lignende metoder blitt beskrevet for metallkarakteriseringer i eukatisk cellekulturarbeid, som også kan vurderes. ^13.13 til 13