Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati

Riconoscimento, aderenza, internalizzazione e degradazione di un agente patogeno sono parte integrante della fagocitosi¹, una via saliente nella risposta immunitaria innata dell’ospite descritta per la prima volta da Ilya Metchnikoff nel 1883^2,3. I leucociti fagocitici, così come altre cellule del sistema immunitario, sono altamente discriminatori nella loro selezione di bersagli; sono in grado di distinguere tra “non-sé infettivo” e “sé non infettivo” attraverso modelli molecolari associati agli agenti patogeni per il loro repertorio di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR)^4,5. Il riconoscimento dell’ospite di un agente patogeno può verificarsi anche con il legame delle opsonine ospiti, come complemento e^{anticorpi 6}. Questo processo, chiamato opsonizzazione, ricopri l’agente patogeno con queste molecole, migliorando l’internalizzazione al legame con i recettori opsonici (ad esempio, complemento e recettori Fc) sulle cellule fagocitiche⁶. Affinché un agente patogeno aderisca a un fagocita, è necessario il legame collettivo di più recettori con i loro ligandi affini. Solo allora l’aderenza può attivare e sostenere le cascate di segnalazione all’interno della cella host per avviare l’internalizzazione⁶.

A causa dell’importanza della fagocitosi nella clearance degli agenti patogeni e nella prevenzione delle infezioni, gli agenti patogeni extracellulari hanno sviluppato numerosi modi per sovvertire questo processo per prolungarne la sopravvivenza. Una strategia importante è la produzione di una capsula polimerica anionica (ad esempio polisaccaride o poliaminoacido) che è anti-fagocitica in virtù della sua carica, è scarsamente immunogenica e protegge le molecole sull’involucro batterico dai PRR^6,7. Agenti patogeni come Cryptococcus neoformans e Streptococcus pneumoniae hanno capsule composte da polimeri saccharide, mentre Staphylococcus epidermidis e alcune specie di Bacillus producono acido poli-ɣ-glutammico (PGGA)^7,8. Tuttavia, altri agenti patogeni producono capsule che assomigliano all’io non infettivo. Ad esempio, lo Streptococcus pyogenes e un ceppo patogeno di B. cereus hanno una capsula di acido ialuronico che non è solo anti-fagocitico ma che potrebbe anche non essere riconosciuta come estranea dal sistema immunitario^9,10.

La coniugazione della capsula in proteine portanti li converte da antigeni poveri e indipendenti dalla T in antigeni altamente immunogenici dipendenti da T che possono indurre alti tigatori di anticorpi anti-capsula sierati^11,12. Questa strategia viene utilizzata per i vaccini autorizzati contro S. pneumoniae, Haemophilus influenzaee Neisseria meningitides¹¹. Le attività opsoniche degli anticorpi anti-capsula sono state comunemente valutate da test di uccisione opsono-fagocitica (OPKA)^13,14,15,16. Questi test testano se gli anticorpi funzionali possono innescare la fagocitosi e uccidere¹⁴. Tuttavia, l’uso di OPKA con agenti patogeni infettivi, come agenti e tossine di selezione biologica di livello 1 (BSAT), tra cui B. anthracis¹⁷, è pericoloso e presenta rischi per la sicurezza; questi saggi richiedono un’ampia gestione di un agente selezionato. La manipolazione di agenti selezionati può essere effettuata solo in laboratori di livello di biosicurezza limitato 3 (BSL-3); il lavoro in questi settori richiede procedure operative prolungate a causa delle numerose precauzioni di sicurezza che devono essere seguite. Anche i laboratori BSL-3 in genere non sono dotati delle attrezzature specializzate utilizzate per il lavoro OPKA, come microscopi e citometri. Pertanto, abbiamo sviluppato un saggio alternativo basato sull’uso di batteri inattivati^18,19. Ci riferiamo a questo come un saggio opsono-aderenza (OAA) che non dipende dall’internalizzazione e dall’uccisione delle uscite di saggio; invece, l’aderenza di agenti patogeni inattivati opsonizzati è usata come indice di fagocitosi. Meccanicamente, L’OAA è un sostituto adatto perché l’aderenza avviene a priori ed è intimamente intrecciata con l’internalizzazione e l’uccisione intracellulare. Dal punto di vista della biosicurezza, l’OAA è preferito perché richiede una manipolazione minima di un agente infettivo, è sperimentalmente di durata inferiore rispetto all’OPKA e può essere eseguito nei laboratori BSL-2 dopo che uno stock di agente patogeno inattivato è stato prodotto e trasferito.

Dimostriamo l’utilizzo dell’OAA per esaminare la funzione opsonica degli anticorpi anti-capsule trovati nei sieri di primati non umani (NMP) vaccinati con un coniugato a capsula [cioè PGGA da B. anthracis coniugato al complesso proteico della membrana esterna (OMPC) di Neisseria meningitides]²⁰. I bacilli opsonizzati al siero sono stati incubati con una linea cellulare di macrofagi di topo aderente, RAW 264.7. Dopo la fissazione, il monostrato cellulare e i bacilli aderenti sono stati immaginiti dalla microscopia a fluorescenza. L’aderenza batterica è aumentata quando i bacilli sono stati incubati con siero da NSP vaccinati con il coniugato della capsula rispetto al siero di controllo²⁰. Aderenza correlata alla sopravvivenza della sfida dell’antrace^20,21. Pertanto, l’uso di OAA ha caratterizzato la funzione degli anticorpi anti-capsula e ha notevolmente facilitato il test del nostro candidato vaccino.