Здесь мы предоставляем протоколы для выполнения трех простых травм индуцированной аксон дегенерации (аксон смерти) анализы в Drosophila меланогастер для оценки морфологического и функционального сохранения отрубленный аксонов и их синапсов.
Дегенерация Аксона является общей особенностью в нейродегенеративных заболеваний и когда нервная система оспаривается механических или химических сил. Однако наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе дегенерации аксона, остается ограниченным. Травма индуцированной аксон дегенерации служит простой моделью для изучения того, как разорванные аксоны выполнять свои собственные разборки (аксон смерти). За последние годы, эволюционно сохраненные аксон смерти сигнализации каскад был определен от мух и млекопитающих, который необходим для разделенного аксона выродиться после травмы. И наоборот, ослабленная смерть аксона приводит к морфологической и функциональной консервации отрубленных аксонов и их синапсов. Здесь мы представляем три простых и недавно разработанных протокола, которые позволяют наблюдать аксональной морфологии, или аксональной и синаптической функции разорванных аксонов, которые были отрезаны от нервного тела клетки, в плодовой мухе Дрозофила. Морфология может наблюдаться в крыле, где частичная травма приводит к смерти аксона бок о бок невредимых аксонов управления в одном и том же нервном пучка. Кроме того, аксональной морфологии также может наблюдаться в головном мозге, где весь нервный пучок подвергается аксон смерти вызвано антенной абляции. Функциональное сохранение разорванных аксонов и их синапсов можно оценить с помощью простого оптогенетического подхода в сочетании с пост-синаптической груминг поведением. Мы представляем примеры с использованием высокой потери функции мутации и чрезмерного выражения dnmnat, как способны задержки аксон смерти в течение нескольких недель до нескольких месяцев. Важно отметить, что эти протоколы могут быть использованы сверх травмы; они облегчают характеристику факторов поддержания нейронов, аксонального транспорта и аксональных митохондрий.
Морфологическая целостность нейронов имеет важное значение для устойчивой работы нервной системы на протяжении всей жизни. Подавляющее большинство объема нейронов берется аксонами1,,2; таким образом, пожизненное содержание особо длинных аксонов является основным биологическим и биоэнергетическим вызовом для нервной системы. Были выявлены несколько аксонально-внутренних и глиально-внутренних механизмов поддержки, обеспечивающих пожизненное выживание аксональных. Их ухудшение приводит к дегенерации аксона3, которая является общей чертой нервной системы оспаривается в болезни, и механические или химические силы4,5. Тем не менее, основные молекулярные механизмы дегенерации аксона остаются плохо изучены ни в одном контексте, что делает разработку эффективных методов лечения для блокирования потери аксона сложной задачей. Развитие эффективных методов лечения от этих неврологических заболеваний имеет важное значение, так как они создают огромное бремя в нашем обществе6.
Травма индуцированной аксон дегенерации служит простой моделью для изучения того, как разорванные аксоны выполнять свои собственные разборки. Обнаруженный и названный в честь Августа Уоллера в 1850 году, Валлерианская дегенерация (WD) является зонтичным термином, который включает в себя два различных, молекулярно отделяемых процессов7. Во-первых, после аксональной травмы, аксоны отделены от их клеточных тел активно выполнять свои собственные самоуничтожения (аксон смерти) через эволюционно сохранены аксон смерти сигнализации каскад в течение одного дня после травмы8. Во-вторых, окружающие глии и специализированные фагоциты занимаются и очищать полученный аксональный мусор в течение трех-пяти дней. Затухание аксона смерти сигнализации приводит к разорванной аксонов, которые остаются сохраненными в течениенедели 9,10,11,12, в то время как затугание глиального поглощения завершается аксонального мусора, который сохраняется в течение нескольких недель в vivo13,14,15.
Исследования на мух, мышей, крыс и зебры показали несколько эволюционно сохраненных и основных посредников аксон смерти сигнализации8. Мутации смерти Аксона содержат отрубленые аксоны и синапсы, которые не могут подвергнуться смерти аксона; они остаются морфологически и функционально сохраняются в течение нескольких недель, при отсутствии поддержки клеточного тела9,,10,,12,,13,,16,,17,,18,,19,,20,,21,,22,23. Открытие и характеристика этих посредников привели к определению молекулярного пути, исполняющего смерть аксона. Важно отметить, что аксон смерти сигнализации активируется не только тогда, когда аксон разрезан, измельчен или растягивается24,25; он также, как представляется, вклад в различных животных моделей неврологических заболеваний (например, где аксоны вырождаются в травмы независимым образом4, но с рядом полезных результатов4,8). Таким образом, понимание того, как аксон смерти выполняет аксон дегенерации после травмы может предложить понимание за пределами простой модели травмы; она могла бы также предусматривать целевые показатели для терапевтического вмешательства.
Плодовая муха Drosophila melanogaster (Drosophila) оказалась бесценной системой для сигнализации смерти аксона. Исследования в лету показали четыре основных эволюционно сохраненных генов смерти аксона: highwire (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 и axundead (axed)12. Модификация этих посредников – потеря функции мутаций hiw, dsarm и топором,и чрезмерное выражение dnmnat – мощно блокирует смерть аксона для продолжительности жизни мухи. В то время как разорванные аксоны дикого типа подвергаются смерти аксона в течение 1 дня, разорванные аксоны и их синапсы, не имеющие приветопта, dsarm или axed остаются не только морфологически, но и функционально сохранены в течение нескольких недель. Может ли также быть достигнуто функциональное сохранение за счет высоких уровней dnmnat еще предстоит определить.
Здесь мы представим три простых и недавно разработанных протокола для изучения смерти аксона (например, морфология и функция разорванных аксонов и их синапсов с течением времени) при отсутствии поддержки клеточного тела. Мы демонстрируем, как ослабленный аксон смерти приводит к разорванной аксонов, которые морфологически сохраняются с hiw потери функции мутации(приветN) и как ослабленный аксон смерти приводит к разорванной аксонов и синапсов, которые остаются функционально сохраняются в течение по крайней мере 7 дней с чрезмерной экспрессии dnmnat (dnmnatOE). Эти протоколы позволяют наблюдать отдельные аксональные и синаптические морфологии либо в центральной, или периферической нервной системы (ЦНС и PNS, соответственно)13,14, в то время как функциональное сохранение отрубленных аксонов и их синапсов в ЦНС может быть визуализирована с помощью простой оптогенетической установки в сочетании с уходом как поведенческие считывания12.
Описанные здесь протоколы позволяют надежное и воспроизводимое наблюдение морфологии, а также функцию аксонов и их синапсов, отделенных от их клеточных тел в Дрозофиле. Обзор крыла облегчает наблюдение аксона смерти бок о бок невредимых аксонов управления в PNS14, в то время как антенный анализ облегчает наблюдение целых нервных пучков GFP помечены аксоны и их синапсы, для оценки морфологии и функции в головном мозге (CNS)12. Есть критические шаги и определенные преимущества для каждого подхода к изучению морфологии, которые должны быть приняты во внимание при разработке экспериментов.
Для наблюдения аксоновой морфологии в PNS в крыле, эксперименты могут быть легко выполнены, из-за прозрачности крыла: это позволяет обойти рассечение и иммуногистохимии. Однако, из-за отсутствия фиксации, крылья должны быть изображены сразу после монтажа14. В настоящее время часто используются два различных драйвера Gal4, либо ok371Gal4 или dprd1Gal4,и обе ссылки предлагают различные подходы к количественной оценке дегенерации14,26. Разрежение маркировки нескольких нейронов рекомендуется, с помощью “Мозаики Анализ с репрессивным маркером клеток (MARCM)”14,31, как разрешение аксональной морфологии является беспрецедентным. В отличие от этого, наблюдение синапсов не представляется возможным в крыльях, они расположены в брюшной нервной шнур внутри грудной клетки мух. Кроме того, дополнительные аксональные маркеры не могут быть визуализированы иммуногистохимией: восковая кутикула делает невозможным распространение фиксатов и антител в подлежащую ткани.
Для наблюдения аксона и синапсовой морфологии в ЦНС, вскрытие мозга должны быть выполнены. Они предлагают преимущество визуализации дополнительных аксональных и синаптических маркеров с помощью иммуногистохимии, а синапсы можно наблюдать вместе с аксонами в том же поле зрения10,13. Большая коллекция характеризуется обонятельный рецептор нейрона (ORN) Gal4 драйверов легко доступны32, и часто, OR22aGal4 является драйвером выбора. Для абляции антенны, тела клетки нейронов OR22a размещаются в3-м сегменте(рисунок 2B). Флуоресценция интенсивности на основе количественной оценки дегенерации либо аксонов или синапсов13. И наоборот, эксперименты отнимают много времени из-за вскрытия мозга и окрашивания антител.
Для визуализации аксональной и синаптической функции после акотомии, оптогенетика используется для запуска антенного ухода: она служит считыванием для функционального сохранения отрубленные аксоны и их синапсы12. Схема ухода и соответствующие сенсорные, между и motorneuron Gal4 водители были тщательно описаны29,30. GMR60E02Gal4 этикетки подмножество органов Джонастона (JO) сенсорных нейронов, которые необходимы и достаточно для ухода29,30. Для абляции антенны, тела клетки нейронов JO размещаются в2-й сегмент антенны(рисунок 2B). Оптогенетической установки можно легко построить с нуля, или существующие настройки скорректированы. Важно отметить, что эксперименты должны быть выполнены в темной комнате, и мухи таким образом визуализированы с инфракрасным (ИК) светодиодный прожектор. При использовании CsChrimson в качестве канала, очень важно поставлять пищу со всеми транс-ретиналя и красный светодиодный прожектор, чтобы активировать JO нейронов29. Кроме того, синие светочувствительные каналы и синий светодиодный прожектор, или канал TrpA1 и температура может быть использована для активации нейронов29,33. Количественная оценка поведения ухода уже описано12,29.
Когда эти анализы используются для специального изучения смерти аксона, важно отметить, что фенотип морфологического или функционального сохранения должен быть надежным с течением времени. Есть случаи, когда смерть аксона приводит к последовательной, но менее выраженный фенотип в морфологическом сохранении34,35, и является ли такой фенотип переводит в функциональное сохранение еще предстоит определить.
Фенотипы смерти Аксон также наблюдались в нейронах во время развития личинок Дрозофилы, где нервы были раздавлены, а не ранены11,23. Здесь мы специально сосредоточились на взрослых нейронах Дрозофилы, которые завершили разработку. В этом контексте, использование РНК-интерференции36, или ткани конкретных CRISPR/Cas937 может быть легко реализована. Важно отметить, что вышеуказанные методы могут быть использованы в аксон смерти независимого контекста: они облегчают характеристику нейрональных факторов обслуживания38, аксональный транспорт39, возраст-зависимых аксональных митохондрий изменения40, и морфологии аксональной митохондрии41.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить всю лабораторию Neukomm за вклад. Эта работа была поддержана Швейцарским национальным научным фондом (SNSF) помощник профессора премии (грант 176855), Международный фонд исследований в параплегии (IRP, грант P180), SNSF Spark (грант 190919) и при поддержке Университета Лозанны и кафедры фундаментальных неврологий (Зтат де Во) в LJN.
Tweezers (high precision, ultra fine) | EMS | 78520-5 | Antennal ablation |
MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge) | EMS | 72933-04 | Wing injury |
1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086.0000 | |
35mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900 | |
Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific™ | BB02400600A113MNT0 | |
Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientific™ | AA00008032E00MNT10 | |
High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter | Thorlabs | DCC1240M | Camera setup |
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
25mm 1/1.2" C mount Lens | Tamron | M112FM25 | |
Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A36 | |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm | Thorlabs | FELH0700 | |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 1" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M10 | |
850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M850L3 | IR LED spotlight |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm | Thorlabs | FELH0850 | |
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M660L4 | Red LED spotlight |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube | Thorlabs | KPS101 | LED control |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | Thorlabs | LEDD1B | |
150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps | Thorlabs | MB1530/M | Mount base |
Ø12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm | Thorlabs | UPH75/M | Mount, 3x (IR LED, red LED, cam) |
Ø1.20" Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap | Thorlabs | SM1RC/M | |
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm | Thorlabs | TR150/M | |
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm | Thorlabs | TR40/M | |
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 5 mm Hex | Thorlabs | RA90/M | |
M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25 | Thorlabs | SH6MS16 | screws for mount onto base |
USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx | National Instruments | 782604-01 | Red LED spotlight controller |
20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer | TT Electronics/BI | P230-2EC22BR20K | fintuner for indicator |
IR (860nm) emitter, 100 mA radial | Osram | 475-1365-ND | Red light indicator |
cable | – | – | Misc |
All-trans retinal | Sigma | R2625 | |
Ethanol absolute | Vwr | 20821.296 | |
Halocarbon Oil 27 | Sigma | H8773 | |
Mowiol | Merk | 81381 | |
Paraformaldehyde | Sigma | F8775 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493 | |
Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning Corp | 4019862 | |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning Corp | 4019862 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Chicken anti-GFP antibodies | Rockland | 600-901-215 | Antibodies |
Goat Dylight anti-Chicken | Abcam | ab96947 | |
FM7a, B | BDSC | RRID:BDSC_785 | X chromosome |
FRT19A[hs-neo] | BDSC | RRID:BDSC_1709 | |
hiw[ΔN] | BDSC | RRID:BDSC_51637 | |
hs-FLP[12] | BDSC | RRID:BDSC_1929 | |
tub-Gal80[LL1] | BDSC | RRID:BDSC_5132 | |
w[1118] | BDSC | RRID:BDSC_3605 | |
20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus | BDSC | RRID:BDSC_55135 | 2nd chromosome |
5xUAS-Gal4[12B] | Kyoto | RRID:Kyoto_108492 | |
5xUAS-HA::dnmnat | BDSC | RRID:BDSC_39702 | |
5xUAS-mCD8::GFP[LL5] | BDSC | RRID:BDSC_5134 | |
ase-FLP[2d] | Freeman laboratory | Neukomm et al., 2014 (PNAS) | |
CyO | BDSC | RRID:BDSC_2555 | |
dpr1-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_25083 | |
OR22a-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_9952 | |
ey-FLP[6] | BDSC | RRID:BDSC_5577 | 3rd chromosome |
GMR60E02-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_39250 | |
TM3,Sb,e | BDSC | RRID:BDSC_3644 |