Preparación de muestras biológicas para la especiación a temperatura criogénica mediante espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución
Summary
Este protocolo presenta un procedimiento detallado para preparar criomuestras biológicas para experimentos de espectroscopia de absorción de rayos X basados en sincrotrón. Describimos todos los pasos necesarios para optimizar la preparación y criopreservación de muestras con ejemplos del protocolo con células de cáncer y fitoplancton. Este método proporciona un estándar universal de criopreparación de muestras.
Abstract
El estudio de elementos con espectroscopia de absorción de rayos X (XAS) es de particular interés cuando se estudia el papel de los metales en los sistemas biológicos. La preparación de muestras es un procedimiento clave y a menudo complejo, particularmente para muestras biológicas. Aunque las técnicas de especiación de rayos X son ampliamente utilizadas, aún no se ha difundido ningún protocolo detallado para los usuarios de la técnica. Además, la modificación del estado químico es motivo de preocupación, y se recomiendan técnicas basadas en crioterapia para analizar las muestras biológicas en su estado hidratado casi nativo para proporcionar la máxima preservación de la integridad química de las células o tejidos. Aquí, proponemos un protocolo de preparación celular basado en muestras criopreservadas. Se demuestra en un estudio de espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución de fluorescencia detectada de selenio en células cancerosas y un estudio de hierro en fitoplancton. Este protocolo se puede utilizar con otras muestras biológicas y otras técnicas de rayos X que pueden dañarse por irradiación.
Introduction
El estudio de las biotransformaciones celulares de elementos esenciales o tóxicos requiere técnicas de especiación con alta sensibilidad y debe minimizar los pasos de preparación de muestras que a menudo son propensos a la modificación de especies químicas.
Se sabe que los elementos fisiológicos como el selenio y el hierro son particularmente difíciles de especificar debido a su química compleja, varias estabilidades de las especies de selenio o hierro, y su baja concentración en el rango de ppm (mg / kg) o incluso sub-ppm. Por lo tanto, el estudio de la especiación de estos elementos por XAS puede ser extremadamente desafiante. El sincrotrón XAS y especialmente la fluorescencia de alta resolución de energía detectada XAS (HERFD-XAS), que permite una relación señal-fondo muy baja1, están disponibles en fuentes de sincrotrón para especiar elementos altamente diluidos en matrices biológicas complejas 2,3. Las mediciones convencionales de fluorescencia-XAS se pueden realizar utilizando un detector de estado sólido (SSD) de energía resuelta con un ancho de banda de energía ~ 150–250 eV, en la línea de haz CRG-FAME en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF)4, mientras que las mediciones HERFD-XAS necesitan un espectrómetro analizador de cristal (CAS), con un ancho de banda de energía ~ 1–3 eV, en la línea de haz CRG-FAME-UHD en el ESRF2 . Los fotones de fluorescencia son discriminados con respecto a su energía con procesos electrónicos u ópticos respectivamente.
La criopreparación de la muestra es esencial para preservar las estructuras y mantener la integridad química de la composición, lo que permite un análisis cercano al estado biológico nativo5. Además, los análisis realizados a temperaturas criogénicas tan bajas como 10 K utilizando enfriamiento criogénico de helio líquido (LN2), permiten que el daño por radiación disminuya la velocidad y preserve la especiación elemental para XAS. Aunque algunas revisiones sobre técnicas XAS aplicadas a muestras biológicas informan de la necesidad de preparar y analizar muestras en condiciones criogénicas (por ejemplo, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), ninguna de ellas describe claramente el protocolo detallado relacionado. En esta publicación, se describe un método para la criopreparación de células cancerosas y microorganismos de plancton para la especiación HERFD-XAS de Se8 y Fe9 a temperatura criogénica.
Las buenas prácticas para la preparación de muestras y el entorno durante las mediciones de espectroscopia XAS de última generación requieren 1) una configuración; 2) un procedimiento de análisis que limite al máximo los efectos del daño por radiación; y 3) una muestra (o referencia de compuesto modelo) lo más homogénea posible con respecto al tamaño del haz de fotones de rayos X. El primer elemento se tiene en cuenta realizando la adquisición a baja temperatura, utilizando un criostato de helio líquido. El segundo ítem se trata realizando cada adquisición en una zona fresca de la muestra moviéndola con respecto a la viga. Finalmente, considerando la tercera condición, las muestras (pellets) y las referencias (polvos) se acondicionan en pellets prensados a granel para limitar al máximo las porosidades e inhomogeneidades, y para evitar la rugosidad con respecto al tamaño del haz en la superficie de la muestra sonda de rayos X. Explicamos cómo el protocolo trata todos estos puntos.
Utilizamos la línea celular de próstata humana PC-3 (alto potencial metastásico) y la línea celular ovárica OVCAR-3 (que representa hasta el 70% de todos los casos de cáncer de ovario) para investigar las propiedades antiproliferativas hacia las células cancerosas de las nanopartículas de selenio (Se-NPs), y la diatomea Phaeodactylum tricornutum como especie modelo para investigar el secuestro de hierro en fitoplancton.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo se utilizó para estudiar la forma química del selenio y el hierro en muestras biológicas mediante espectroscopia de absorción de rayos X. Se centra en la criopreparación y almacenamiento de muestras biológicas y compuestos de referencia, así como en las mediciones HERFD-XAS.
Criopreparación y almacenamiento
La criopreparación de los pellets de muestra biológica a granel permite preservar la integridad química de las especies presentes en las muestr…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos las contribuciones financieras al desarrollo de la línea de haz por parte de CEMHTI (Orleans, Francia, ANR-13-BS08-0012-01) y Labex OSUG@2020 (Grenoble, Francia, ANR-10-LABX-0056). El proyecto FAME-UHD cuenta con el apoyo financiero del “grand emprunt” francés EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), el consorcio CEA-CNRS CRG y el instituto INSU CNRS. Estamos agradecidos de todas las contribuciones durante los experimentos, especialmente a todas las personas que trabajan en BM30B y BM16. Los autores reconocen la Instalación Europea de Radiación sincrotrón para la provisión de tiempo de haz de radiación sincrotrón. También reconocemos el proyecto PHYTOMET ANR por apoyo financiero (ANR-16-CE01-0008) y el proyecto SEDMAC por apoyo financiero (INCA-Plan cáncer-ASC16019CS).
Materials
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
Referencias
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