Markerless Gene Deletion par Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

La chlamydia trachomatis est la principale cause de maladies bactériennes sexuellement transmissibles et représente un fardeau important pour la santé humaine. Plus de 100 millions de personnes sont infectées chaque année par C. trachomatis¹. Environ 70% des infections chez les femmes sont asymptomatiques en dépit des effets néfastes sur la santé reproductive, tels que la maladie inflammatoire pelvienne, la grossesse extra-utérine, et / ou l’infertilité. La séquelle de la maladie est directement liée à l’immunopathologie initiée par l’infection à C. trachomatis ². Un vaccin efficace n’a pas encore été mis au point; par conséquent, la compréhension de la fonction des facteurs de virulence bactérienne et d’autres produits de gène bactérien est une question importante et urgente de recherche.

Comme bactéries intracellulaires, l’invasion de cellules d’hôte, la réplication intracellulaire, la libération de la progéniture, et l’évasion des réponses immunologiques d’hôte sont des processus critiques. C. trachomatis forme un vacuole lié de membrane parasitophore, appelé une inclusion, pour le développement intracellulaire. L’établissement de l’inclusion et de nombreux autres processus critiques sont obtenus par la sécrétion de protéines effecteurs via un système de sécrétion de type III (T3SS)³. L’élucidation des fonctions de ces effecteurs sécrétés a été limitée pendant de nombreuses années en raison de l’intraitabilité génétique de C. trachomatis. Contrairement à E. coli, de nombreuses techniques classiques de clonage ne sont pas applicables à la chlamydia. Quelques limitations majeures impliquent l’efficacité de transformation, le manque de journalistes de contre-sélection tels que sacB, et l’entretien plasmide. Alors que les plasmides E. coli peuvent généralement être maintenus indéfiniment avec une origine de réplication et une pression sélective appropriée, les plasmides de C. trachomatis nécessitent huit cadres de lecture ouverts supplémentaires(pgp1-8) pour l’entretien qui se trouvent sur le plasmide pL2 indigène dans le sérovar^{L2 4}.

Ces dernières années, il ya eu de multiples outils génétiques générés qui accueillent la biologie unique de la chlamydia, mais il ya encore des limitations^5,6,7. La mutagénèse chimique par le traitement de l’éthylique methanesulfonate (EMS) peut introduire des mutations de mauvais sens, ou (moins fréquemment) peut avoir comme conséquence des transitions de nucléotide introduisant un codon prématuré d’arrêt pour produire une mutation non-sens^8. L’insertion de Transposon est efficace pour la perturbation des gènes, mais la technologie actuelle dans la recherche sur la chlamydia est laborieuse et prend du temps⁹. Le traitement du SME et les techniques de mutagénèse transposon génèrent des mutations aléatoires et nécessitent des méthodes de dépistage rigoureuses pour isoler les souches mutantes. Une méthode pour perturber les gènes par l’insertion d’introns du groupe II (p. ex. TargeTron) permet une mutagénèse dirigée; cependant, cette méthode est limitée par l’efficacité, et le site d’insertion n’est pas toujours correctement prédit¹⁰.

La mutagénèse d’échange allélique (FRAEM) rapportée par fluorescence est une stratégie utilisée pour la suppression ciblée de gène couplée à l’insertion d’une cassette de sélection fournissant la résistance antibiotique et d’un journaliste de fluorescence¹¹. Pourtant, FRAEM est compliqué par le potentiel des effets polaires induits par cassette sur les gènes en aval, en particulier lors du ciblage des gènes dans les operons polycistroniques. La mutagénèse d’échange allélique de cassette floxed (FLAEM) est une nouvelle approche génétique développée pour alléger les effets polaires cassette-induits précédemment observés avec la cassette de sélection de FRAEM^12. FLAEM utilise l’édition du génome De Cre-loxP pour enlever la cassette de sélection et restaurer l’expression des gènes en aval. La cassette de sélection contenant une résistance aux antibiotiques et une protéine fluorescente verte (GFP) est repensée avec des sites de loxP flanquants. Ces sites loxP peuvent se recombiner en présence de Cre recombinase et entraîner l’excision de la cassette du génome¹³. Cette stratégie a été montrée pour alléger les effets polaires induits par cassette en ciblant tmeA pour la suppression^12,14.

Les méthodes FRAEM et FLAEM utilisent le même vecteur de suicide, le pSUmC 4.0, qui peut être maintenu sous condition par l’expression inductible du pgp6. L’expression du pgp6 a été précédemment montrée pour être nécessaire pour la conservation de plasmide et est donc exploitée pour commander l’entretien de plasmide^11,15. Lorsque C. trachomatis est cultivé dans des médias complétés par la tétracycline anhydre (aTc) pour induire l’expression pgp6, le vecteur est maintenu. En l’absence d’aTc, le vecteur est perdu. La suppression ciblée de gène est réalisée par l’échange allélique du gène pour la cassette de sélection. Les régions de 3 kb directement en amont et en aval du gène ciblé servent de bras d’homologie pour la recombinaison. Ces bras sont clonés dans le vecteur pSUmC 4.0 flanquant la cassette de sélection. Des événements réussis de transformation et de recombinaison de C. trachomatis sont observés par le rapport de fluorescence. L’expression de mCherry sur l’épine dorsale vectorielle et le gfp dans la cassette de sélection donnent des inclusions fluorescentes rouges et vertes. Une fois que l’aTc est retiré des médias de culture, les inclusions vertes seulement indiquent des événements réussis de recombinaison avec la perte du vecteur de suicide et l’intégration de la cassette de sélection dans le génome bactérien.

FLAEM représente une extension de FRAEM par la transformation ultérieure d’un vecteur cre recombinase-exprimant, pSU-Cre, dans la souche mutante nouvellement créée. Cre recombinase facilite la recombinaison entre les sites loxP et l’excision de la cassette de sélection. Les événements de recombinaison sont indiqués par rapport de fluorescence. Le vecteur pSU-Cre code mCherry; ainsi, la transformation réussie est indiquée par l’addition de la fluorescence rouge aux inclusions gfp-exprimant. La culture en l’absence de pression sélective pour la cassette entraîne une recombinaison à médiation cre sur les sites de loxP, et la perte de la cassette est indiquée par des inclusions rouges seulement. Comme avec pSUmC-4.0, l’expression inductible de pgp6 est employée pour maintenir conditionnellement pSU-Cre. Une fois que la sélection d’aTc et d’antibiotiques est enlevée, le plasmide est guéri, et la souche de suppression sans marqueur résultante est non fluorescente. Cette méthode aborde la question des effets polaires induits par les cassettes.