Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması

Postganglionik sempatik nöronlar (symNs) otonom sinir sistemine ait (ANS) ve yanıt ve bilinç bağımsız vücudun homeostaz düzenlenmesinde birden fazla önemli rolleri vardır. Örneğin, stres symNs uyarır ve kalp hızı, kan basıncı ve terleme bir artışa yol açan mücadele-veya-uçuş yanıtı çağrıştırıyor. SymNs genetik nedeniyle birden fazla insan bozuklukları etkilenir, toksisite / yaralanma, ya da diğer hastalıklara yardımcı olarak. Genetik nöropati nin bir örneği çocukluk çağı bozukluğu Ailesel Disotonomi (FD), symNs şiddetli bir disregülasyon disotonomik krize neden olur, terleme ile belirgin, cilt lekeleme, kusma atakları, hipertansiyon, ve anksiyete¹. Toksisite bir örnek kemoterapi tedavisi, hangi otonom nöronlar üzerinde toksik yan etkileri olduğu bildirilmiştir². Bu otonom denervasyon ve hiper-innervasyon hem yol açabilir bilinmektedir, ya da eşlik, Parkinson hastalığı veya hipertansif böbrek hastalığı gibi hastalıklar^3,4. Bu nedenle, symN biyolojisi ve hastalıkları bağlamında kusurların mekanlarını araştırabilmek ve anlayabilmek, yeni ve etkili tedavilerin araştırılmasında faydalıdır.

Anatomi
Periferik sinir sistemi duyusal ve otonom bölünmeleriçine dallar. Duyusal sinir sisteminin afferent sinirler ağrı ve dokunma hissi sorumludur, ANS beyne tüm organlardan bilgi geçişi sorumludur ise. ANS enterik sinir sistemi ayrılır, gastrointestinal sistem innerve, parasempatik sinir sistemi, hangi gevşeme için önemlidir, ve sempatik sinir sistemi (SNS), hangi aktivasyon / organların düzenlenmesi için önemlidir. SNS iki nöronlu bir sistem⁵uyarlar. Omurilikte preganglionik sempatik nöral aksonlar ilk olarak postganglionik symN hücre organlarının bulunduğu sempatik ganglia’ya proje lenir. Bu nöronlar daha sonra vücuttaki her organın hedef dokuları innerve etmek için uzun projeksiyonlar göndermek. Preganglionik nöronlar tarafından iletilen sinyaller kolinerjiktir, postganglionik symNs adrenerjik ve böylece ekspres norepinefrin (NE) ana nörotransmitter olarak. Postgangliyonik birkaç önemli istisnalar vardır, kolinerjik sempatik nöronlar, kan damarları innerve olanlar da dahil olmak üzere. Adrenerjik postgangliyonik nöronlar tirozin hidroksilaz (TH), aromatik L-amino asit dekarboksilaz (AAAD), dopamin β-hidroksilaz (DBH) ve monoamin oksidaz (MAO-A), tüm üreten ve metabolize NE sorumlu enzimleri ifade. Ayrıca, ne geri dönüşüm taşıyıcıları ve /veya reseptörleri α-adrenerjik reseptör (ADRA2), β-adrenerjik reseptör (ADR2B), norepinefrin taşıyıcı (NET1) ve vesiküler monoamin taşıyıcı (VMAT1/2) ifade ederler.

Geliştirme
Embriyonik gelişim symNs sırasında nöral tepecik türetilmiştir (NC), hangi nöral tüp ve overlaying ektoderm arasında ortaya çıkar⁶, ve birden fazla hücre soyları ayırt edebilirsiniz, melanositler de dahil olmak üzere, osteoblastlar, adipositler, glia, enterik nöronlar, duyusal nöronlar, ve otonom nöronlar⁷. Nöral krest hücreleri (NVR) embriyo ile çeşitli yolları almak son derece göçmen hücrelerdir. NC gelişiminin bu erken aşamasında, hücreler işaretleri SNAIL1/2, FOXD3 ve SOX10^8,9,,10,11ifade . Benimsedikleri eksenel konumla birlikte geçiş rotası, geliştirecekleri NC alt türünü belirler. Bu NC alt tipleri kendi özel HOX gen ekspresyonu ile ayırt edilebilir: Kranial NCC’ler HOX genlerini ifade etmez, vagal NCC’ler HOX 1-5 ekspres, gövde NCCs ekspres HOX 6-9, ve sakral NCCs ekspres HOX 10-11¹². Bunlar arasında, gövde NCCs symNs ana kaynağı olarak kabul edilmektedir. SymN öncüleri transkripsiyon faktörü MASH1/ASCL1¹³ifade , PHOX2B¹⁴ ve INSM1¹⁵ifade teşvik . GATA ailesi transkripsiyon faktörleri geç sempatik gelişim sırasında ifade edilir. GATA2 ve GATA3 symNs ifade edilir, hangi sırayla DBH¹⁶aktive . Transkripsiyon faktörü HAND2 de ifade ve DBH ve TH¹⁷bakım için önemlidir.

HPSCs (örneğin, embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücreler) güçlü bir araç¹⁸ gelişimsel paradigmalar özetlemek ve daha sonra çeşitli insan bozukluklarının hastalık modelleme için istihdam edilebilir symNs oluşturmak. Bu nedenle, hPSCs gelen symNs oluştururken, gelişimsel yönergeleri takip etmek ve farklılaşma süreci boyunca uygun belirteçleri ifade değerlendirmek çok önemlidir.

Önceki symN protokolü
Birkaç araştırma grupları daha önce hPSCs^19,,20,,21gelen symNs nesil bildirdin. Birbirlerine bu protokollerin doğrudan karşılaştırma ve bizim son zamanlarda²²gözden geçirildi . 2016²³yılında symN karakterli otonom nöronların üretimi için bir ayırım protokolü yayınladık (Şekil 1A). Bu protokol, hem farklılaşmamış hPSC’lerin bakımında hem de hücre farklılaşmasında kullanılan KSR tabanlı ortam kullanılmıştır. Ayrıca fare embriyonik fibroblastlarında (MEF besleyici hücreler) hPSC’ler tutuldu. Biz bozukluğu modellemek için FD hastalarından bu protokol ve PSCs istihdam²³. 2019 yılında, bu eski protokol²⁴daha ayrıntılı bir sürümünü açıkladı. Özetle, nöral kader ilk 2 gün içinde TGF-β ve BMP sinyalini engellemek için çift SMAD inhibisyonu²⁵ ile indüklendi. CHIR99021 kullanarak WNT aktivasyonu NC hücreleri haline nöral ataları terfi etti. 11. günde hücreler, CD49D⁺ veya SOX10⁺ popülasyonlar^26,23için FACS tarafından sıralandırıldı, bu da yaklaşık %40 NC üretim verimliliği elde etti. Böylece, farklılaşma sonraki adımlar için verimlilik ve saflık sağlamak için sıralama gerekli oldu. NNC’ler FGF2 ve CHIR kombine tedavisi ile küresel olarak muhafaza edildi ve güçlendirilmiş. 4 gün sonra, bakım NC spheroids kaplama ve BDNF verildi, GDNF, ve NGF symN olgunlaşma bitirmek için. Bu symN’ler ASCL1, TH, DBH ve PHOX2A gibi güçlü symN belirteçlerini ifade etse ler de, nikotinik asetilkolin reseptörünün (CHRNA3/CHRNB4) ve vezikül taşıyıcısının (VMAT1/2) ekspresyonu da dahil olmak üzere daha olgun symN’ler için belirteçler 70 günlük farklılaşmadan sonra bile düşüktü. Bu protokoldeki HOX genleri resmi olarak test edilmedi ve hücrelerin elektrofizyolojik aktivitesi de dahil olmak üzere olgun nöral özellikler doğrulanmadı.

Burada, symNs oluşturmak için optimize edilmiş bir protokol salıyoruz (Şekil 1B). HPSC’ler besleyicisiz koşullarda, vitronektin (VTN) kaplamalı yemeklerde, Essential 8 (E8) media²⁷kullanılarak muhafaza edilir. Farklılaşma ortamının formülü her aşamada değiştirilerek NC popülasyonunun yüzdesi^28’dir. SymN olgunlaşma CD49D⁺/SOX10⁺ sıralanmış veya sıralanmamış toplu NCC popülasyonları üzerinde yapılabilir. Her ikisi de 30. Ayrıca, bu protokol ile oluşturulan symNs elektrofizyolojik kayıt ve symN aktivatör ve inhibitör bileşikleri ile tedavilere duyarlıdır.