ヒト尿由来細胞から得られた直接再プログラムされた筋チューブでのエキソンスキップ

国立神経精神医学センターの倫理委員会は、この研究を承認しました(承認ID:A2017-018、A2018-029)。すべての個人は尿を提供する前にインフォームド・コンセントを与えました。すべての実験は、関連するガイドラインと規制の下で行われました。 1. UDC の分離と主要な文化 注: UDC は、以前に公開されたプロトコル8、9,、10に従って分離されました。, 殺菌されたペットボトルの自然なミチュレーションの間に尿サンプルを集める。注:外尿道オリフィスの殺菌は必要ありません。中流尿は、ウイルス汚染のリスクを低減することが望ましい。次の手順の前にストック時間が>1時間である場合、尿サンプルは細胞の生存率を維持するために4°Cに移す必要があります。しかし、不溶性沈殿物が現れるため、<4°Cの温度は避けるべきです。 尿サンプル全体を室温で10分間400xgで遠心分離する。 g 上清を吸引し、チューブに1mLを残す。 残りの1mLの尿中にペレットを個別に再懸濁し、それらを単一の50 mLチューブに集める。 カルシウムとマグネシウムを含まない99mLのPBS、ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)1%、0.5 μg/mLアンホテリシンB、遠心分離機を200xgで室温で10分間加えます。 g 上清を吸引し、チューブに0.2mLを残す。 ピルビン酸ナトリウムを含まない高グルコースダルベックの改変イーグル培地(DMEM)と組換えヒト表皮成長因子(EGF)を補ったハムのF-12栄養混合物の1:1混合物で構成される一次培地の4.5 mLで細胞ペレットを再懸濁し、 インスリン、 ヒドロコルチゾン、エピネフリン、T3、トランスフェリン、10%テトラサイクリンフリーウシ胎児血清(FBS)、1%P/S、および0.5 μg/mLアンホテリシンB。 ゼラチンコーティング6ウェルプレート(各ウェルの総体積、1.5 mL)の3つのウェルに細胞を播種します。培養液は37°C、CO2を5%2で24時間加湿した。 次の3日間、1.5 mLのプライマリメディアを毎日追加します。 4日目に、組換えヒトEGFを添加した1.5mLの成長培地に交換し、 インスリン、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、T3、トランスフェリン、15%テトラサイクリンフリーFBS、0.5%L-アラニン-L-グルタミン、0.5%非必須アミノ酸、および2.5 ng/mL線維芽細胞増殖因子-塩基(bFGF)、組換えヒトプレート誘導因子(PDGF)、EGF、および1/1%P/1%P/1%。 1日おきに成長培地を変更します。注: UDC コロニーは 1 週間以内に出現します。 UDC培養が80-90%コンフルエントになったら、培地を取り除き、PBSで細胞を洗浄し、0.25%トリプシンEDTAを使用してすべての細胞を分割し、3,000-5,000細胞/cm2で新しいゼラチンコーティングされた60mm皿に播種します(通路1)。注: UDC は液体窒素で保管できます。UDCは通常、60 mm培養皿の60~70%の合流度で3つのストックチューブに分けられます。 2. レトロウイルスコンストラクト ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、MYOD1(NM_002478.4)プラスミドのコード領域を増幅します。注: MYOD1増幅とサーマルサイクラーの条件の混合物を表1と表 2にそれぞれ示します。 増幅PCR産物の1μLを用いて約1,000bpサイズのアガロースゲル電気泳動で1バンドを検出し、MYOD1配列が正常に増幅されたことを確認します。 クリーンアップキットを使用してPCR製品を洗浄し、分光光度計で濃度を決定します。 一晩37°Cで表3に示すように混合物をインキュベートし、複数クローニング部位の制限酵素標的領域においてTet-on系およびピューロマイシン耐性遺伝子を用いてレトロウイルスベクターを消化する。 1つのバンドを0.7%のアガロースゲル電気泳動で検出し、1μLの消化物を使用して、レトロウイルスベクターが正常に消化されたことを確認します。 クリーンアップキットを使用して消化された製品を洗浄し、分光光度計によってその濃度を決定します。 増幅されたMYOD1フラグメント(ステップ 2.1-2.3 で生成される)を、消化されたレトロウイルスベクター(ステップ 2.4-2.6 で生成)にクローン化するには、融合中クローニング反応を実行します。表4に示すように反応を設定し、50°Cで15分間反応をインキュベートし、氷の上に置きます。 メーカーの指示に従って大腸菌のコンピテントセルを使用して変換を行います (資料表)。 10 g/L バクトトリプトン、5 g/L バクト酵母エキス、5 g/L NaCl、15 g/L バクト寒天、および 50 mg/L アンピシリンからなる LB 培養プレート上で培養することにより、形質転換されたコンピテント 細胞を選択します。 選択したコロニーと培養液を、一晩37°Cで200rpmでバクト寒天なしでLB培養培地でピックアップする。 プラスミド精製キット(材料表)を使用してMYOD1挿入レトロウイルスベクターを精製し、分光光度計を使用して定量化します。 挿入されたMYOD1配列を横切って両側にそれぞれ標的とするフォワードおよびリバースプライマーによって増幅されたPCR産物の直接シーケンシングによって、MYOD1がレトロウイルスベクターに正しく挿入されることを確認する。注: MYOD1シーケンスは、融合中のクローニングが成功した場合に、レトロウイルスベクター配列の間に挟まれた検出が可能です。 レトロウイルス産生のために、10cmコラーゲンコーティングプレートの50,000細胞/cm2で包装細胞を播種し、DMEMで10Sを加湿して37°C、5%CO2で224時間培養します。 包装細胞が80%の合流に増殖する場合、30μgのMYOD1-挿入レトロウイルスベクター、30μgの包装ベクター、および細胞貫通ペプチド(材料表)を含むトランスフェクション試薬を渦で混合し、10分間インキュベートします。 37°Cおよび5%CO2で加湿した培養細胞および培養液にインキュベートした混合物を加える。注:コラーゲンのコーティングが必要です。培養液は、培養プレートから細胞を分離しやすいため、播種後24時間以上で良い場合があります。 4時間または一晩後、培地を新たな成長培地に変更する。 ウイルス上清を収集し、コトランスフェクション後24時間と48時間で新鮮な培地に置き換え、上清を組み合わせます。 ウイルス上清を濃縮するには、濃縮試薬と混合し、一晩で37°Cでインキュベートし、4°Cで45分間1,500 x gで遠心分離機を行います。 レトロウイルス上清を0.45μmの孔でPVDFフィルターでフィルターします。 メーカーの指示に従って定量PCRキットとサーマルサイクラーシステムを使用して、レトロウイルスベクターの力乗をチェックしてください。 ウイルス上清を小さなアリコートに分け、-80°Cでストックします。 3. UDCにおけるMYOD1-レトロウイルスベクターの感染 ゼラチンコーティングされた60mm皿に3,000-5,000セル/cm2でUDCをシードします。 24時間の播種後、解凍したレトロウイルス(ステップ2.21)を、8μg/mLの濃度でヘキサジメトリン臭化物を加えることによって、200の感染の多重度に感染する。 37°Cおよび5%CO2で24時間の培養を加湿した後2、培養培地を1μg/mLピューロマイシンを含む新鮮な成長培地に置き換えて、MYOD1-トランスデューブ細胞を選択する。1 日おきにメディアを変更します。注意:MYOD1陽性細胞を選択する場合、通常1μg/mLのピューロマイシンが選択に使用されます。適切な用量を決定する必要があります。.未感染細胞を含むプレートを使用し、3-5日にすべての細胞を殺す用量を選択してください。MYOD1-陽性細胞は、ピューロマイシンを添加してから7〜10日以内に選択する必要があります。MYOD1-トランスデュースされたUDCは液体窒素で貯えることができる。 4. 3-デアザネプラノシンA塩酸塩(DZNep)で処理されたMYOD1-トランスデュースUDCの筋形成分化 注:最近、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤であるDZNepが、後期筋調節因子の1つであるMYOGENINの発現を有意に促進し、また、ミオチューブ分化7を導く可能性があると報告されている。 プレートMYOD1- 3.5 x 104細胞/cm2の密度でコラーゲンコーティングウェル内の UDC を導入しました。培養は37°C及び5%CO2で2加湿した。 24時間後、L-アラニン-L-グルタミン、5%馬血清、ITSサプリメント、1 μg/mLドキシサイクリン、および5 μM DZNepを用いた高グルコースDMEMで構成される分化培地に成長培地を変更します。注:10 mM DZNepソリューションは-80°Cで3ヶ月間保存できます。霜を取り除く冷凍庫を使用し、凍結融解サイクルを繰り返さないようにします。ドキシサイクリンとDZNepによって活性化されたMYOD1の両方が増殖を抑制し、UDCの心因性分化を促進する。したがって、ドキシサイクリンおよびDZNepは、筋形成分化の誘導後に添加することが推奨される。DZNepは、用量依存的な方法でMYOD1-UDCの筋原性分化を促進する。一方、高濃度で細胞毒性を示す。したがって、筋原性分化および細胞生物学的利用能への影響に応じて、1-10 μMの範囲のDZNepの適切な濃度を決定します。 3日後、DZNepを使用せずに新しい分化培地に分化培地を変更する。次に、3日ごとに培地を交換する。注:UDCは互いに融合し、分化後1〜2週間以内にミオチューブを形成します。 5. MYOD1変換された UDC でのエキソンスキップ 注:ここでは、患者由来細胞におけるエキソンスキップを評価する3つのプロトコルが記載されています:1)ジストロフィンmRNAの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)。2)ウェスタンブロットによる回復ジストロフィンタンパク質シグナルの半定量化;3)免疫細胞化学による回復したジストロフィン蛍光シグナルの半定量化。すべての方法は、用量依存的な方法でエキソンスキップを検出することができます。 RT-PCRによるエキソンスキップ効率の評価 7日目にDMD患者から得られたオリゴヌクレオチド(ASO)を、分化後7日目に得られたMYOD1変換UDCにトランスフェクトするには、ASO、トランスフェクション試薬(材料表)を混合し、最終濃度1〜10μMに分化培地を37°Cおよび5%CO2で加湿した培養液。2 ASOで72時間のインキュベーションを行った後、ASOを使用せずに培地を新鮮な分化培地に変更する。 ASOトランスフェクションの3~7日後から、分化培地を取り出し、PBSで1倍洗います。細胞のリシスバッファーを追加し、UDCを解凍し、RNA抽出キットを使用して全RNAを収穫します。 分光光度計でRNA濃度を測定します。 表 5に従って、PCR チューブに 1 ステップ RT-PCR 反応に必要な試薬を組み合わせます。 PCR チューブを混合した温度サイクルに入れます。表 6に従ってサーモサイクラーを実行します。 マイクロチップ電気泳動を行い、以下のようなモル濃度を用いてエキソンスキップ効率を算出する。エクソンスキップ効率(%)=スキップバンド/(スキップバンド+非スキップバンド)x 100注:PCR製品は、短期保存用に4°C、長期保存用に-20°Cの冷蔵庫に保管してください。 ウェスタンブロッティングによるエキソンスキップ後のジストロフィンの検出 ステップ5.1.1および 5.1.2 に従ってトランスフェクト ASO および培養 MYOD1 -UDC. 3日ごとにメディアを変更します。 分化の2週間後、プロテアーゼ阻害剤を含む放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝液を用いて培養細胞から全タンパク質を抽出する。 氷上のライゼを、遠心分離機で14,000 x gで4°Cで15分間超音波処理します。 上清を収集し、BCAタンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を決定します。 0.5 mLチューブに全タンパク質15μgを加え、プロテアーゼ阻害剤を含むRIPAバッファーを総体積10μLに加えて希釈し、1レーン当たり15μgの全タンパク質を実行します。 表7に示すように、サンプルバッファー、還元剤、脱イオン水を加える。細胞ライセートを70°Cで10分間変性させる。 8.95 g/L トリシン、6.06 g/Lトリスベース、1.0 g/Lドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含むトリス酢酸ランニングバッファーを準備します。 サンプル(20 μL)をトリス酢酸3-8%ゲルにセットし、150 Vで75分間電気泳動を行います。 メタノールを使わずにブロッティングバッファーを準備します。 PVDF膜を20 sメタノールに浸し、次にブロッティングバッファーに浸して使用するまで(少なくとも10分)PVDF膜をミニゲルで6 x 8 cm、ミディゲルで8 x 12 cmのサイズに切ります。 ブロッティングペーパーをPVDF膜と同じサイズに切り、使用するまでブロッティングバッファに浸します。 電気泳動後、PVDF膜と同じ大きさのゲルを切り、蒸留水に浸します。 ブロッティングペーパー、PVDF膜、およびゲルをセミドライ転写装置に配置する(図1)。4 mA/cm2で 30 分間転送します。 膜2xを蒸留水でリンスします。 抗ジストロフィン(1:500)および抗α-チューブリン(1:1,200)抗体を一次抗体として調製する。 HRP結合抗マウス抗体(1:100)を二次抗体として調製する。 膜を一次抗体でインキュベートし、洗浄バッファーで洗浄し、室温で自動化された西洋処理装置(材料表)を使用して二次抗体と共にインキュベートします。注:抗α-チューブリン抗体は、通常、負荷制御として使用されます。1:500抗ジストロフィンおよび1:1,200抗α-チューブリン抗体を含む混合一次抗体溶液は、抗体反応が同時に行われるとうまく機能します。 蒸留水で膜をすすい。 化学発光検出試薬と電荷結合デバイス(CCD)カメラベースのイメージャーを使用してタンパク質を検出します。 適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。 免疫細胞化学によるエキソンスキップ後のジストロフィンの検出 ステップ 4.1-4.3 に従って、UTUBE をコラーゲンコーティング 96 ウェルプレートで直接ミオチューブに再プログラムします。 ステップ 5.1.2 および 5.1.3 に従って ASO および培養MYOD1-UDC をトランスフェクトします。 分化2週間後、PBSで細胞を洗浄し、4°Cで10分間、4%パラホルムアルデヒドに固定します。 MYOD1-UDCを室温で10分間0.1%の非イオン性洗剤で透過し、37°Cで15分間ヤギ血清10%の液剤を遮断します。 一次抗体を4°Cで一晩インキュベートする。 細胞をPBSで洗浄し、二次抗体で室温で30分間インキュベートします。注:ここでは、マウス抗ジストロフィン(1:30)が一次抗体として使用され、抗マウスIgGが二次抗体として使用され、そしてHoechst(1:10,000)が核染色に使用されます。 蛍光顕微鏡を使用してプレートを画像化し、アナライザーを使用して、同じ条件下のすべてのウェルで蛍光信号を自動的に半定量化します。