Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi
Summary
Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.
Abstract
Organoidler, fizyolojik süreçleri bir yemeğin rahatlığıyla özetleyen kendi kendini organize eden, üç boyutlu doku yapıları sunar. Murine meme bezi farklı işlevlere hizmet veren iki farklı epitel hücre bölmesi oluşur: dış, kontraktil miyoepitelyal bölmesi ve iç, salgı luminal bölmesi. Burada, bu bölmelerden oluşan hücrelerin izole edildiği ve daha sonra meme bezi morfogenezine ve farklılaşmaya olan bireysel soy katkılarını araştırmak için biraraya geldiği bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem basit ve verimlidir ve floresan aktif hücre sıralama gibi gelişmiş ayırma teknolojileri gerektirmez. Bunun yerine, biz hasat ve enzimatik doku sindirmek, yapışık doku kültürü yemekleri üzerinde epitel tohum, ve sonra ~ 90% saflık ile luminal hücrelerden miyoepitel ayırmak için diferansiyel trippsinizasyon kullanın. Hücreler daha sonra kültürde 10 gün sonra süt üretmek için ayırt edilebilir çift katmanlı, üç boyutlu (3D) organoidler halinde organize bir hücre dışı matris plakalı. Genetik mutasyonların etkilerini test etmek için, hücreler vahşi tip veya genetiği değiştirilmiş fare modellerinden hasat edilebilir, ya da genetik olarak 3D kültürden önce manipüle edilebilir. Bu teknik, özellikle luminal veya miyoepitel bölmesi gen fonksiyonunun araştırılmasına olanak sağlayan mozaik organoidler oluşturmak için kullanılabilir.
Introduction
Meme bezi (MG) bir adiposit zengin stroma içinde gömülü bir ağaç gibi, tübüler epitel yapısıdır. İki katmanlı duktal epitel, kontraktilin dış, bazal tabakası, miyoepitel hücreleri (Myoecs) ve luminal, salgı epitel hücrelerinin (LECs) bir iç tabakası, merkezi bir lümen çevreleyen oluşur1. Emzirme sırasında dış MiyoECs iç alveoler LECs süt sıkmak için sözleşme, MG büyüme faktörleri (örneğin, EGF ve FGF) ve hormonlar (örneğin progesteron, insülin ve prolaktin kontrolü altında olan çok sayıda değişiklik uğrar, ve prolaktin). Bu değişiklikler, emzirme döneminde sütü sentezleyen ve salgılayan özel yapılar alveollerin farklılaşmasına neden olur1. Meme epitel deneysel ya epitel doku parçaları, hücreler, hatta tek bir bazal hücre konak meme yağ pedleri içine nakledilir teknikleri kullanılarak manipüle edilebilir, endojen meme parenkim precleared, ve bütün bir yeniden büyümeye izin, fonksiyonel epitel ağacı2,3,4,5. Transplantasyon güçlü bir tekniktir, ancak bir mutasyonun erken embriyonik öldürücülükle sonuçlanması (E14’ten önce) nakledilebilir meme nin kurtarılmasını önlerse zaman alıcı dır ve imkansızdır. Ayrıca, araştırmacılar sık sık soy kısıtlı ata hücreleri türetilmiştir iki farklı bölmeleri, rolleri araştırmak istiyorum. Cre-lox teknolojisi MyoEC’lerin ve LED’lerin diferansiyel genetik manipülasyonuna olanak sağlarken, bu aynı zamanda zaman alan ve pahalı bir girişimdir. Böylece, 1950’lerden bu yana, araştırmacılar meme dokusu yapısı ve fonksiyonu ile ilgili soruları ele almak için nispeten kolay ve verimli bir yol olarak in vitro meme organoidler kullandık6,7.
Birincil meme epitel hücrelerinin izolasyon ve kültürünü açıklayan erken protokollerde, araştırmacılar bir plazma pıhtısı ve tavuk embriyoekstresi oluşan bir bazal membran matris (BME), mg parçaları bir çanak yetiştirilen için gerekli olduğunu bulundu6. Takip eden yıllarda, hücre dışı matrisler (EcMs, kollajen, ve engelbreth-Holm-Swarm murine sarkomu hücreleri tarafından salgılanan jöle benzeri protein matris) 3D kültürü kolaylaştırmak ve daha iyi in vivo çevre7taklit geliştirilmiştir,8,9,10. Birden fazla kriter (morfoloji, gen ekspresyonu ve hormon duyarlılığı) tarafından ortaya 3D matrislerde culturing hücreleri böyle bir mikroortamda vivo fizyolojiksüreçlerdedaha iyi modeller 9,10,11,12. Birincil mindik hücreleri kullanılarak yapılan araştırmalarda, organoidlerin uzun süreli bakımı ve farklılaşması için gerekli olan temel büyüme faktörleri ve morfojenler saptandı13. Bu çalışmalar burada sunulan protokol için zemin hazırladık, ve 3D organoidler olarak insan meme hücrelerinin kültürü için, şimdi modern bir klinik araçtır, hasta örnekleri üzerinde ilaç keşif ve ilaç testi için izin14. Genel olarak, organoid culturing birincil hücrelerin kendi kendine organizasyon kapasiteleri ve morfogenez ve farklılaşma katkıları vurgulamaktadır.
Burada sunulan süt üreten acini içine ayırt edilebilir kültür murine epitel için bir protokoldür. İki farklı MG hücre bölmesini oluşturan MiyoEC’leri ve LEC’leri izole etmek için diferansiyel trippsinizasyon tekniği kullanılır. Bu ayrılmış hücre fraksiyonları daha sonra genetik olarak aşırı ifade veya nakavt gen fonksiyonu için manipüle edilebilir. Çünkü soy-içsel, kendi kendine organizasyon meme epitel hücrelerinin doğuştan gelen birözelliğidir 15,16,17, bu hücre fraksiyonları rekombinerek araştırmacılar çift katmanlı, mozaik organoidler oluşturmak için izin verir. Biz enzimatik yağ dokusu sindirerek başlar, ve daha sonra 24 saat için bir doku kültür çanak üzerinde meme parçaları kuluçka(Şekil 1). Doku parçaları polistiren tabaklar üzerinde iki katmanlı parçalar olarak in vivo organizasyon: iç luminal katmanları çevreleyen dış miyoepitelyal tabaka yerleşmek. Bu hücresel organizasyon, dış MiyoEC’lerin tripsin-EDTA (%0.05) ile izolasyonuna izin verir. tedavi 3-6 dk ve ardından ikinci bir tripsin-EDTA turu (%0.05) kalan iç LEC’leri ayıran tedavi (Şekil 2). Bu nedenle farklı tripsin duyarlılığı olan bu hücre tipleri izole edilir ve daha sonra ECM ile karıştırılarak kaplanabilir (Şekil 3). Hücreler, iç LEC’leri çevreleyen MiyoEC’lerin dış tabakasından oluşan iki katmanlı küreler oluşturmak için kendi kendini örgütlemeden geçerler. Lümen oluşumu hücreler büyüme faktörleri nin bir kokteyl içeren bir ortamda büyümek gibi oluşur (Büyüme Orta için tariflere bakın)13. 5 gün sonra, organoidler Alveologenesis Medium’a geçerek süt üreten acini’ye ayrılabilir (bkz. tarifler ve Şekil 3F)ve 5 gün daha kuluçkaya yatırılabilir. Alternatif olarak, organoidler en az 10 gün boyunca Büyüme Ortamı’nda genişlemeye ve dallanmaya devam edecektir. Organoidler immünororesans(Şekil 3D-F)kullanılarak analiz edilebilir veya ecm’den bir kurtarma solüsyonu kullanılarak serbest bırakılabilir (bkz. Malzeme Tablosu)ve diğer yöntemlerle analiz edilebilir (örn. immünoblot, RT-qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, araştırmacıların birincil MG hücrelerini kullanarak 3D organoid kültürleri nasıl üretebildiğini anlatan bir yöntem sunulmuştur. Bu ve diğer protokoller arasındaki fark, iki ayrı MG hücre bölmesi ayırmak için bir yöntem detay olmasıdır: dış bazal MiyoECs ve iç LECs. Yöntemimiz iki aşamalı tripsin-EDTA (%0.05) kullanır diferansiyel tripsinizasyon dediğimiz tedavi19. Bu prosedür, araştırmacıların gelişmiş akış sitometrisi kullanmadan MiyoeC’leri ve LEC’l…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ben Abrams’a Kaliforniya Üniversitesi, Santa Cruz (UCSC) Kök Hücrelerin Biyolojisi Enstitüsü’nden (IBSC) teknik yardım ve çekirdek destek için teşekkür ederiz. Susan Strome ve Bill Saxton’a Solamere İplik Disk Konfokal Mikroskobu’nu kullandıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Howard Hughes Tıp Enstitüsü’nden UCSC’ye James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study programı (S.R.), NIH’den (NIH GM058903) öğrenci gelişimini en üst düzeye çıkarma (H.M.) ve Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursu (O.C. DGE 1339067) ve bir hibe (A18-0370) UC-Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi (LH) tarafından.
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
Referencias
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Biología del desarrollo. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O’Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
