Whitefly Dokularında Begomovirüslerin İmmünfloresan ve Kantitatif PCR ile Lokalizasyonu ve Nicel Olarak Ölçülmesi
Summary
Böcek dokularında begomovirüslerin lokalizasyonu ve nicelemesi için immünoresans ve nicel PCR yöntemini tanımladık. İmmünofloresan protokolü viral ve vektör proteinleri kolokalize etmek için kullanılabilir. Kantitatif PCR protokolü tüm whitefly organları ve virüs bulaşmış bitkilerde virüsleri ölçmek için uzatılabilir.
Abstract
Begomoviruses (cins Begomovirus, aile İkizler )kalıcı, dolaşımcı bir şekilde Bemisia tabaci kompleksinin whiteflies tarafından iletilir. Begomovirüslerin dünya çapında üretime verdiği büyük hasar göz önüne alındığında, begomovirüsler ve onların whitefly vektörü arasındaki etkileşimi anlamak zorunludur. Bunu yapmak için, vektör dokularında virüsün lokalizasyonu ve nicelleştirilmesi çok önemlidir. Burada, örnek olarak domates sarı yaprak kıvırcık virüs (TYLCV) kullanarak, biz whitefly midguts begomoviruses lokalize etmek için ayrıntılı bir protokol tarif, primer tükürük bezleri, ve immünororesans ile yumurtalıklar. Yöntem, bir virüs kat protein, boya etiketli ikincil antikorlar ve konfokal mikroskop karşı spesifik antikorların kullanımına dayanmaktadır. Protokol aynı zamanda begomoviral ve whitefly proteinleri colocalize için kullanılabilir. Ayrıca whitefly midguts, primer tükürük bezleri, hemolenf ve yumurtalıklarda tylcv sayısallaştırılması için bir protokol açıklar kantitatif PCR (qPCR). TYLCV için özel olarak tasarlanmış astarlar kullanılarak, nicelleştirme protokolleri, whitefly’ın farklı dokularında TYLCV miktarının karşılaştırılmasına olanak sağlar. Açıklanan protokol, bir beyaz sinek ve virüs bulaşmış bir bitkinin vücudundaki begomovirüslerin sayısallaştırılması için potansiyel olarak yararlıdır. Bu protokoller whitefly begomoviruses dolaşım yolunu analiz etmek için veya whitefly-begomovirus etkileşimleri çalışma için diğer yöntemlerin bir tamamlayıcısı olarak kullanılabilir.
Introduction
Son yıllarda, begomoviruses (cins Begomovirus, aile İkizler )birçok sebze üretimine ciddi zarar neden oldu, lif, ve süs bitkileri dünya çapında1. Begomoviruses whitefly Bemisia tabaci tarafından kalıcı bir şekilde iletilir (Hemiptera: Aleyrodidae), hangi üzerinde içeren karmaşık bir tür 35 şifreli türler2,3. Begomoviruses doğrudan veya dolaylı olarak whitefly fizyolojisi ve davranış etkileyebilir, fecundity4gibi , uzun ömür4, ve konaktercihi 5,6. Ayrıca, belirli bir begomovirüs türlerinin iletim verimliliği / zorlanma farklı whitefly şifreli türler için bile aynı deneysel koşullar altında değişir7,8,9,10, begomovirüsler ve beyaz sinekler arasında karmaşık bir etkileşim olduğunu gösteren. Whitefly-begomovirus etkileşimlerinin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için, whitefly dokularında virüsün lokalizasyonu ve nicelemesi esastır.
Domates sarı yaprak kıvırcık virüs (TYLCV) ilk İsrail’de bildirilen bir begomovirus ama günümüzde domates üretimi dünya çapında ciddi hasara neden olur11,12. Ekonomik önemi nedeniyle, en iyi çalışılan begomoviruses13biridir. Diğer monopartite begomoviruses gibi, TYLCV yaklaşık bir genom boyutu ile tek iplikli dairesel DNA virüsü14. Hala tartışma altında iken, kanıt çeşitli satırları whiteflies15,16,17TYLCV çoğaltılması destek . Ayrıca, TYLCV parçacıkları ve whitefly proteinlerin etkileşimi bildirilmiştir6,18,19,20. Virüs bulaşması için, beyaz sinekler virüs bulaşmış bitkilerle beslenerek TYLCV elde, virions yemek borusuna ulaşmak için besin kanalı boyunca geçmek, hemolenf ulaşmak için midgut duvar nüfuz, ve daha sonra birincil tükürük bezleri içine translocates (PSGs). Son olarak, virions bitki phloem içine tükürük kanalı boyunca tükürük ile egestedvardır 21. Ayrıca, çeşitli çalışmalar TYLCV transovarial dişi beyaz sinekler kendi yavrularına22,23iletilir mümkün olduğunu göstermektedir. Başka bir deyişle, verimli iletim elde etmek için, virüs bir dokudan diğerine translocate için whitefly içinde hücresel engelleri aşmak zorundadır. Bu engellerin aşılması sırasında, whitefly ve virüs proteinleri arasındaki etkileşimler muhtemelen virüslerin bulaşma verimliliğini belirleyen oluşabilir.
İmmünofloresans protein dağılım analizi nde yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Antikorların antijenlerine bağlanan özgüllüğü immünfloresansın temelini oluşturur. TYLCV’nin ekonomik önemi nedeniyle, TYLCV kat proteinine karşı monoklonal antikorlar geliştirilmiştir ve virüsün lokalize edilmesi için son derece hassas bir yol24geliştirilmiştir. Kantitatif PCR (qPCR) nükleik asitlerin hassas ve spesifik nicelemasını sağlar. Bu teknik en sık hidroliz probu (örneğin, TaqMan) veya floresan boya (örneğin, SYBR Green) tespiti kullanımına dayanır. Hidroliz prob tabanlı qPCR için, belirli problar gereklidir, bu da dolayısıyla maliyeti artırır. Floresan boya bazlı qPCR daha basit ve daha uygun maliyetlidir, çünkü etiketli amplicon spesifik hibridizasyon probları25. Şimdiye kadar, çeşitli çalışmalarda karmaşık begomovirus-whitefly etkileşimleri araştırmak için diğer yöntemlerle birlikte immünoresans ve qPCR kullandık. Örneğin, Pan ve ark. whitefly dokularda virüsün qPCR ve immünoforeskence analizi yapıldı ve beyaz sinek türleri AsiaII 1 ve Orta Doğu Asya Küçük 1 (MEAM1) arasında tütün kıvırcık ateş virüsü (TbCSV) iletmek için yeteneği farkı etkili AsiaII1 ama MEAM1 8 midgut duvar çapraz edememek için virüs nedeniyle bulundu8. Benzer şekilde, Akdeniz (MED) beyaz sinekler kolayca TYLCV iletebilirsiniz iken, onlar domates sarı yaprak kıvırmak Çin virüsü (TYLCCNV) iletmek için başarısız. Seçici iletim, TYLCCNV’nin MED whiteflies26’nınPSG’lerini kolayca geçmediğini gösteren PSG’lerde immünororesans virüsü nisbi tespiti kullanılarak araştırıldı. TYLCV CP ve whitefly midguts otofaji marker protein ATG8-II immünofloresan kolokalizasyonu otofin whitefly27TYLCV enfeksiyonu baskı kritik bir rol oynadığını göstermektedir.
Burada, örnek olarak TYLCV kullanarak, bir immünofloresan tekniği ile whitefly midguts, PSGs ve yumurtalıklarda begomovirüslerin lokalizasyonu için bir protokol açıklar. Bu teknik, primer ve boya etiketli ikincil antikorlarla diseksiyon, fiksasyon ve kuluçkayı içerir. Floresan sinyalleri daha sonra bir konfokal mikroskop altında tespit edilebilir whitefly dokularda viral proteinlerin yerini gösteren. Daha da önemlisi, bu protokol begomoviral ve whitefly proteinleri colocalize için kullanılabilir. Ayrıca, farklı whitefly doku örneklerinde virüs miktarını karşılaştırmak için kullanılabilecek whitefly midguts, PSGs, hemolenf ve yumurtalıklarda SYBR Yeşil tabanlı qPCR kullanılarak TYLCV’nin sayısallaştırılması için bir protokol tanımlayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada immünororeskence ve qPCR ile whitefly vektördokularında bir begomovirüs lokalizasyonu ve nicelleştirme için bir protokol açıklar. Diseksiyon, whitefly dokularında virüsün lokalize ve ölçülmesiiçin ilk adımı temsil eder. Whitefly vücut dokuların son derece küçük olduğu anlamına gelir uzunluğu yaklaşık 1 mm, ve onları incelemek zordur. Ayrıca, dokular arasında güçlü bağlantılar vardır. Örneğin, yumurtalıklar sıkıca bakteriyofitler ile bağlı, onları izole etmek zor hale. Bu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (Hibe numarası: 2017YFD0200600), Çin Tarım Araştırma Sistemi (hibe numarası: CARS-23-D07) ve Bill & Melinda Gates Vakfı (Yatırım Kimliği OPP1149777) için ayrılmış fon tarafından desteklenmiştir ). Prof. Jian-Xiang Wu’ya TYLCV CP antikorları sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
Referencias
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus – a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
