Localizzazione e quantificazione dei begomovirus nei tessuti delle mosche bianche mediante immunofluorescenza e PCR quantitativo

Negli ultimi decenni, i begomovirus (genere Begomovirus, famiglia Geminiviridae) hanno causato gravi danni alla produzione di molte colture vegetali, fibre e ornamentali in tutto il mondo¹. I begomovirus sono trasmessi in modo persistente dalla mosca bianca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), che è una specie complessa che contiene oltre 35 specie criptiche^2,3. I begomovirus possono influenzare direttamente o indirettamente la fisiologia e il comportamento delle mosche bianche, come la fecondità^4,la longevità⁴e la preferenza host^5,6. Inoltre, l’efficienza di trasmissione di una determinata specie/ceppo di begomovirus varia per diverse specie criptiche della mosca bianca anche nelle stesse condizioni sperimentali^7,8,9,10, indicando che esiste una complessa interazione tra begomovirus e mosche bianche. Per comprendere meglio i meccanismi alla base delle interazioni bianco-begomovirus, la localizzazione e la quantificazione del virus nei tessuti della mosca bianca sono essenziali.

Pomodoro giallo foglia curl virus (TYLCV) è un begomovirus che è stato segnalato per la prima volta in Israele, ma al giorno d’oggi provoca gravi danni alla produzione di pomodoro in tutto il mondo^11,12. Grazie alla sua importanza economica, è uno dei begomovirus più studiati¹³. Come altri virus begomovirus monopartitici, TYLCV è un virus del DNA circolare a singolo filamento con una dimensione del genoma di circa 2.800 nucleotidi¹⁴. Mentre ancora in discussione, diverse linee di prova supportano la replica di TYLCV in whiteflies^15,16,17. Inoltre, l’interazione delle particelle TYLCV e delle proteine delle mosche bianche è stata segnalata^6,18,19,20. Per la trasmissione del virus, le mosche bianche acquisiscono TYLCV nutrendosi di piante infettate dal virus, i virioni passano lungo il canale alimentare per raggiungere l’esofago, penetrano nella parete centrale per raggiungere l’emolfo, quindi si traslocano nelle ghiandole salivari primarie (PSG). Infine, i virioni sono estratta con saliva lungo il condotto salivare in phloem²¹. Inoltre, diversi studi dimostrano che TYLCV è in grado di essere trasmesso transovarialmente dalle mosche bianche femminili alla loro prole^22,23. In altre parole, per ottenere una trasmissione produttiva, il virus deve superare le barriere cellulari all’interno della moschea bianca per traslocare da un tessuto all’altro. Durante l’attraversamento di queste barriere, è probabile che si verifichino interazioni tra le proteine delle mosche bianche e del virus, probabilmente determinando l’efficienza con cui i virus vengono trasmessi.

L’immunofluorescenza è una tecnica comunemente utilizzata per l’analisi della distribuzione delle proteine. La specificità degli anticorpi che si legano al loro antigene costituiscono la base dell’immunofluorescenza. A causa dell’importanza economica di TYLCV, sono stati sviluppati anticorpi monoclonali contro la proteina del cappotto TYLCV, offrendo un modo altamente sensibile per localizzare il virus²⁴. La BICR quantitativa (qPCR) consente la quantificazione sensibile e specifica degli acidi nucleici. Questa tecnica si basa più frequentemente sull’uso di sonda idrolisi (ad esempio TaqMan) o rilevamento di coloranti fluorescente (ad esempio, SYBR Green). Per qPCR basato su sonda idrolisi, sono necessarie sonde specifiche, che di conseguenza aumentano il costo. Il qPCR fluorescente basato su coloranti è più semplice e conveniente, perché le sonde di ibridazione specifiche per amplicon etichettate non sono richieste²⁵. Finora, diversi studi hanno usato l’immunofluorescenza e il qPCR insieme ad altri metodi per studiare le complesse interazioni begomovirus-mosca bianca. Ad esempio, Pan et al. ha eseguito l’analisi qPCR e immunofluorescenza del virus nei tessuti della mosca bianca e ha scoperto che la differenza nella capacità di trasmettere il virus del germoglio riccio di tabacco (TbCSV) tra le specie di mosca bianca AsiaII 1 e Medio Oriente Asia Minore 1 (MEAM1) era dovuta al fatto che il virus era in grado di attraversare in modo efficiente la parete centrale dell’AsiaII1 ma non MEAM1⁸. Allo stesso modo, mentre le mosche bianche mediterranee (MED) possono trasmettere facilmente TYLCV, non riescono a trasmettere il virus cinese a ricciolo a foglia gialla pomodoro (TYLCCNV). La trasmissione selettiva è stata studiata utilizzando il rilevamento dell’immunofluorescenza del virus nei PSG, il che ha dimostrato che tyLCCNV non attraversa facilmente i PSG delle mosche bianche MED²⁶. La co-localizzazione dell’immunofluorescenza di TYLCV CP e la proteina marcatore di autofagia ATG8-II nei midguts della mosca bianca mostrano che l’autofagia svolge un ruolo fondamentale nel reprimere l’infezione di TYLCV nella moschea bianca²⁷.

Qui, usando TYLCV come esempio, descriviamo un protocollo per la localizzazione dei begomovirus nei midgut, nei PSG e nelle ovaie con una tecnica di immunofluorescenza. La tecnica include la dissezione, la fissazione e l’incubazione con anticorpi secondari primari e con coloranti. I segnali di fluorescenza che mostrano la posizione delle proteine virali nei tessuti della mosca bianca possono quindi essere rilevati al microscopio confocale. Ancora più importante, questo protocollo può essere utilizzato per colocalizzare proteine begomovirale e whitefly. Descriviamo inoltre un protocollo per la quantificazione di TYLCV utilizzando QPCR a base verde SYBR in midgut, PSG, emolymph e ovaie, che può essere utilizzato per confrontare la quantità di virus in diversi campioni di tessuto a mosca bianca.