Verduidelijken en beeldvorming Candida albicans Biofilms
Summary
Om de interne kenmerken van Candida albicans biofilms te bekijken en te kwantificeren, bereiden we vaste intacte exemplaren voor die worden verduidelijkt door refractieve indexmatching. Vervolgens kan optische sectioning microscopie worden gebruikt om driedimensionale beeldgegevens te verkrijgen, hoewel de volledige dikte van de biofilm.
Abstract
De microbiële schimmel Candida albicans kan een verandering ondergaan van evenredige kolonisatie naar virulentie die sterk is gecorreleerd met zijn vermogen om over te schakelen van gist-vorm groei naar hyphal groei. Cellen die dit proces initiëren, worden zowel aan- als aan elkaar verbonden, met als gevolg de ontwikkeling van een biofilmkolonie. Dit komt vaak niet alleen voor op slijmvliesweefseloppervlakken bij schimmelinfecties, maar ook op medische implantaten zoals katheters. Het is algemeen bekend dat biofilmcellen resistent zijn tegen schimmeldodende geneesmiddelen, en dat cellen die uit de biofilm worden vergoten, kunnen leiden tot gevaarlijke systemische infecties. Biofilms variëren van zwaar doorschijnend tot ondoorzichtig als gevolg van refractieve heterogeniteit. Daarom zijn schimmelbiofilms moeilijk te bestuderen door optische microscopie. Om interne structurele, cellulaire en subcellulaire functies te visualiseren, verduidelijken we vaste intacte biofilms door stapsgewijze oplosmiddeluitwisseling tot een punt van optimale brekingsindexmatching. Voor C. albicans biofilms wordt voldoende duidelijkheid bereikt met methylsalicylaat (n = 1.537) om confocale microscopie van top tot basis mogelijk te maken in biofilms van 600 μm met weinig demping. In dit visualisatieprotocol schetsen we fasecontrastrefractometrie, de groei van laboratoriumbiofilms, fixatie, kleuring, oplosmiddeluitwisseling, de installatie voor confocale fluorescentiemicroscopie en representatieve resultaten.
Introduction
Candida albicans is een microbiële schimmel die meestal commensal is bij de mens. Het is van fundamenteel belang voor biologen omdat het organisme meerdere morfologieën heeft. Bijvoorbeeld, in reactie op bepaalde milieusignalen of stressoren, gist-vorm ontluikende cellen zal overschakelen naar filamenteuze groei als septating ketens van zeer langwerpige cellen bekend als hyphae. De overgang is belangrijk als een voorbeeld van fenotypische expressie van een overgang tussen een eencellig en meercellig genexpressieprogramma. Ook C. albicans is van biomedisch belang omdat het organisme een bekende opportunistische ziekteverwekker is. Het is verantwoordelijk voor slijmvliesschimmelinfecties zoals spruw (orale candidiasis), urogenitale infecties, en een oorzaak van gevaarlijke invasieve of systemische infecties bij immunologisch verzwakte patiënten.
Het potentieel van dit organisme voor virulentie is nauw verbonden met zijn meervoudige morfotypes en andere aspecten van zijn genetische veelzijdigheid1,2,3,4. Kiembuisextensie, de eerste zichtbare fase van de overgang naar hyphalgroei, treedt met voldoende snelheid op om verzwolgen C. albicans cellen in staat te stellen uit phagocyten te breken en zo te ontsnappen aan een vroege fase van de cellulaire immuunrespons van de gastheer5. Bovendien wordt filamentatie voorafgegaan en gepaard gegaan met een grote toename van cel-cel-cel-en-cel-naar-oppervlakte hechting die te wijten is aan gereguleerde expressie van verschillende klassen van celwand eiwitten bekend als adhesinsen6,7,8,9. Onder een breed scala van omstandigheden resulteert de combinatie van therapietrouw en filamentatie in een dramatische verschuiving van planktonische, eencellige groei naar oppervlaktegerelateerde koloniale groei die een biofilm vormt. C. albicans biofilms kunnen ontwikkelen op gemeenschappelijke geïmplanteerde medische hulpmiddelen zoals veneuze katheters. Verspreide infecties kunnen het gevolg zijn wanneer dergelijke biofilms beginnen te bud off gist-vorm cellen en vergoten ze in circulerend bloed. Meerdere studies hebben aangetoond dat biofilmcellen beter bestand zijn tegen schimmeldodende geneesmiddelen dan planktoncellen10,11, wat deels te wijten kan zijn aan verlaagd metabolisme12. Bovendien kan de hoge algehele aanhankelijkheid van een biofilm de verankering bieden die nodig is voor een efficiënte invasieve groei van hyphae in gastheerweefsel1.
Optische verduidelijking van C. albicans biofilms door brekingsindex matching heeft een grote invloed gehad op ons vermogen om de structuur van deze microbiële gemeenschap te visualiseren en relaties tussen genexpressie en fenotype te ontdekken. Biofilms die in het laboratorium worden gekweekt op testoppervlakken onder vloeibaar kweekmedium gedurende 48 uur, verschijnen als een witachtige coating die dicht genoeg en dik genoeg is om ondoorzichtig te zijn (figuur 1). Daarom zijn veel interessante fenotypische kenmerken van de biofilm aan het zicht onttrokken. De 24 h wilde type biofilms geteeld in YPD, RPMI-1640, of Spider medium op 37 ° C bereik tot 300 μm dik, met 48 h biofilms vaak bereiken 500 μm. De dekking is te wijten aan lichtverstrooiing, die ontstaat door refractieve heterogeniteit: de schimmelcelwand is refractiever dan het omringende medium en het cytoplasma iets refractiever dan de celwand. De resulterende hoge optische dichtheid van een native biofilm verduistert alle structuren meer dan 30 μm diep wanneer bekeken met een conventionele microscoop of zelfs een confocale scanner (Figuur 2). Echter, een grote mate van verduidelijking kan worden bereikt door het infiltreren van vaste biofilms met een hoge brekingsindex vloeistof die ongeveer overeenkomt met de refractievan de grote cellulaire bestanddelen. Na verduidelijking kan beeldvorming bij submicron-resolutie worden uitgevoerd door confocale microscopie door de gehele dikte van bijna elke C. albicans biofilm13. In wilde type specimens, is het gemakkelijk om te zien dat biofilms bestaan uit lange verstrengelde hyphae, clusters van gekiemde gist-vorm cellen of pseudohyphal cellen, lege ruimten, en een bepaalde hoeveelheid extracellulaire matrix. Bovendien zijn biofilms over het algemeen gestratificeerd, met ruimtelijk variante morfologische verschillen in celtype, celdichtheid en de aanwezigheid van ontluikende of vertakkende cellen. Veel variaties in een of meer van deze kenmerken zijn waargenomen in biofilms ontwikkeld door mutant stammen14,15. Daarnaast tonen verslaggeversstammen in situ ruimtelijke verschillen in genexpressie16,9,13. De verrassende mate van verduidelijking verkrijgbaar met deze relatief eenvoudige en goedkope aanpak maakt het ook mogelijk om te zien dat veel biofilms apicalhyphae en basale invasieve hyphae uit te breiden tot millimeter afstanden.
In dit visualisatieprotocol demonstreren we de bevestiging, etikettering, verduidelijking en beeldvorming van een C. albicans biofilm met behulp van een eenvoudige celwandmarker als vlek. De oorsprong van de huidige versie van het protocol is de verbeterde helderheid die we waarnamen toen formaldehyde-vaste biofilms werden geïnfiltreerd met 97% glycol methacrylaat (GMA), die vervolgens werd gepolymeriseerd om de biofilm in te bedden in een hard plastic met een matig hoge brekingsindex (n = 1,49). Vervolgens hebben we conventionele fasecontrastmicroscopie en een reeks brekingsreferentievloeistoffen gebruikt om het contrastpunt (maximale transparantie) van de biofilm(figuur 3) nauwkeuriger te bepalen. Voor C. albicans biofilms gebeurde dit in de buurt van n = 1.530, wat verrassend hoog was gezien het feit dat een dichte eiwitstructuur zoals haarkeratine slechts iets refractiever is (1.54–1,55). Hoewel het aan de bovenkant van het optimale bereik in figuur 3,hebben we methylsalicylaat (olie van wintergroen, n = 1.537) in het huidige protocol, omdat het al lang gebruikt als een verhelderende agent voor microscopie in de embryologie en histologie, het heeft een lage toxiciteit en lage dampdruk, en het gaf uitstekende resultaten in onze proeven met behulp van matige-NA olie onderdompeling optica.
Hier moeten vier punten worden gemaakt:
(1) Op enkele uitzonderingen na is de ideale situatie in de microscopie dat de brekingsindex van het monster gelijk moet zijn aan de brekingsindex van de objectievelensonderdompelingsvloeistof 17,18,13. Voor driedimensionale (3D) beeldvormingsstudies waarbij diep scherpstellen noodzakelijk is, is dit altijd belangrijk.
(2) Ons experimenteel resultaat voor optimale clearing (n = 1.525–1.535) is iets hoger dan standaard onderdompelingsoliën (n = 1.515, 1.518) en schendt derhalve punt (1) en introduceert dus een bron van sferische aberratie bij het gebruik van standaard olieonderdompelingsoptiek. Een oplossing voor dit probleem is het gebruik van een doelstelling ontworpen voor een onderdompeling sindex in het hogere bereik. Door de heropleving van de belangstelling voor beeldvorming van gerooide specimens komen speciale doelstellingen met de benodigde correctie beschikbaar. De andere oplossing is om de index van het verhelderende medium aan te passen tot 1.515 of 1.518 door toevoeging van een kleine hoeveelheid butanol (n = 1.399) voor optimale olieonderdompelingprestaties en de licht aangetaste helderheid te accepteren.
(3) Microscopie van intacte biofilms (en andere specimens op deze schaal) vereist een aanzienlijke werkafstand om de dikte van het monster aan te passen. Dit is een belangrijke praktische overweging. Een lange werkafstand beperkt de optiek tot een matig numeriek diafragma (NA = 0,6–1,25), wat de resolutie beperkt, maar ook de ernst van de sferische aberratie beperkt.
(4) De optimale brekingsindex ter verduidelijking kan voor andere soorten vaste specimens anders zijn. Specimens moeten dienovereenkomstig worden getest aan de hand van fasecontrast en een reeks refractieve referentievloeistoffen voor index, zoals aangegeven in figuur 3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vooruitgang in fluorescentie microscopie in optische sectie, resolutie, snelheid, vermijden of compensatie van aberratie, multichannel acquisitie, en in rekenkracht, hebben geleid tot een heropleving in de beeldvorming intacte exemplaren. Voor vaste exemplaren hebben zowel klassieke als nieuwe verduidelijkings- en uitbreidingsmethoden een grote impact gehadop 19,20,21,22,23,24. In dit geval hebben we een snelle en eenvoudige op oplosmiddelgebaseerde indexmatchingbenadering toegepast om de structuur van schimmelbiofilms te bestuderen die sterk doorschijnend tot ondoorzichtig zijn.
De voorgaande protocollen zijn getest met een reeks exemplaren. In ons laboratorium worden Candida albicans biofilms meestal geteeld op 14 mm vierkanten gesneden uit een vel siliconenrubber van medische kwaliteit (zie Tabel met materialen). Dit substratum wordt gebruikt omdat de groei op PDMS (poly-dimethylsiloxane) ondergedompeld in vloeibare cultuur medium is vastgesteld als een belangrijk in vitro model voor infecties in verband met medische implantaten, met name inwonende katheters. Gestreste cellen die filamentatie initiëren, hechten zich snel aan niet-polaire oppervlakken zoals PDMS. In de praktijk geven gebruikte vierkanten die zijn gereinigd en opnieuw gesteriliseerd in een autoclave (droge cyclus) de meest consistente biofilms voor een bepaalde stam. Biofilms worden ook vaak geteeld op cover glazen, in cover glas bodem cultuur gerechten, in standaard bacteriologische kwaliteit polystyreen gerechten, en op agar. Omdat C. albicans cellen niet goed hechten aan glas, moet de cover bril worden behandeld met een lectine dat celwand polysachariden zal binden. We passen 40 μL van 1 mg/mL ConA of WGA in steriel water aan op elk dekslipoppervlak. Na het drogen worden de afdekglazen behandeld met 40 μL van 1% glutaraldehyde gedurende 3 min om het eiwit te crosslinken tot een onoplosbare film. Ze worden vervolgens gewassen met steriel gedestilleerd water om de fixatieve en oplosbare lectine en luchtgedroogd te verwijderen. Indien nodig worden de behandelde afdekglazen of gerechten gedurende 10 min opnieuw gesteriliseerd onder een kiemdodende UV-lamp.
De dikte van het monster heeft invloed op de vereiste incubatietijd in de protocollen. Fixatieve diffusie in een 300 μm biofilm vergt enkele minuten om te equilibraten. Deze periode neemt toe als het kwadraat van het monster dikte, en moet worden uitgebreid tot een uur of meer voor zeer dikke biofilms of agar blok exemplaren die kunnen worden 2-3 mm dik. De evenwichtstijd voor kleuring hangt ook af van de dikte van het monster zoals beschreven voor de bevestiging en washout. Echter, omdat de lectines diffuus langzamer dan de low-MW fixatiefen, vooral binnen een agar gel, vlekken moeten worden verlengd ‘s nachts. Hetzelfde moet worden gedaan voor het washout van overtollige vlek.
Vlekken van verschillende soorten kunnen in de protocollen worden opgenomen. We gebruiken een celwandvlek voor structurele beeldvorming, meestal Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) of een lectine met kleurstof, zoals ConA-Alexafluor 594 of WGA-Alexafluor 594. Er moet aandacht worden besteed aan de valency van het eiwit. De ConA tetramer kan crosslinking van zeer flexibele hyphae veroorzaken in het apicale gebied van een biofilm. Dit is minder duidelijk met de WGA dimer. De canonieke specifieke kenmerken van deze markers zijn Calcofluor voor chitine, ConA voor manneusresten en WGA voor N-acetyl-D-glucosamine en sialic acid residues.
Omdat het oplosmiddeluitwisselingsprotocol is ingedeeld uit PBS of water dat methanol in methylsalicylaat is, moeten monstercontainers oplosmiddelbestendig zijn. Methylsalicylaat (MS) zal snel polystyreen plasticware verzachten en langzaam andere kunststoffen verzachten. Het protocol stappen tot het gebruik van de nette methanol kan worden uitgevoerd in plasticware, maar op dat punt in het protocol schakelen we over het algemeen over naar standaard 20 mL glas scintillatie flesjes met oplosmiddelbestendige schroefdoppen. De flesjes zijn handig voor biofilms op siliconen vierkante substrata, omdat de pleinen kunnen worden opgehaald en overgebracht met behulp van fijne pincet. Ook kan een flacon worden afgevoerd en bijgevuld met het vlakke vierkant dat op het binnenste gebogen oppervlak rust, zodat de biofilm geen contact maakt met het glas. Het substratum moet biofilm-up zijn wanneer het in het rechtopstaande flesje wordt ondergedompeld. De flesjes zijn uitstekend geschikt voor langdurige monsteropslag.
In het verduidelijkingsprotocol minimaliseren meer gesorteerde oplosmiddeluitwisselingsstappen het risico op vervorming van het monster als gevolg van oplosmiddelmengeffecten. Voor snelheid en gemak in het basisprotocol zijn er vier stappen: 1) stap 3.3, PBS tot 50:50 PBS:methanol; 2) stappen 3.4 en 3.5, PBS:methanol tot nette methanol, 3) stap 3.6, nette methanol tot 50:50 methanol:MS; en 4) stappen 3.7 en 3.8, methanol:MS tot nette MS. Methanol zorgt voor de overgangsmiscibility. Omdat water en MS echter bijna immiscible zijn, is het van essentieel belang dat al het water door methanol wordt verplaatst vóór de introductie van ms. Evenzo, omdat methanol zeer vluchtig is, is het belangrijk om alle methanol door MS te verplaatsen. Anders is het voortgezette de voortzetting van de voortzetting van de verdamping van restmethanol zal refractieve indexvariaties in het monster veroorzaken. Binnen de vier stappen volgorde, het herhalen van de tweede en vierde stappen door het toevoegen van een andere verandering van netjes oplosmiddel, of zelfs een derde verandering, is raadzaam. Voor bijzonder kwetsbare exemplaren kunnen oplosmiddelveranderingen in kleinere procentstappen worden geformuleerd.
Met agar blok specimens, stappen 3.4 en 3.5 (nette methanol) kan leiden tot het verschijnen van zoutkristallen in de agar als gevolg van de onoplosbaarheid van resterende PBS zouten in de methanol. Dit kan worden vermeden door gedestilleerd water (DW) te gebruiken in de eerste gemengde oplosmiddelstap in plaats van PBS om zouten te verdunnen tijdens de wateruitwisseling:methanol. De alternatieve oplosmiddeluitwisselingssequentie voor vaste biofilms bestaat dan uit de volgende stappen: 1) stap 3.3, breng het monster van PBS over naar 50:50 DW:methanol (laat extra tijd voor verspreiding via agar); 2) stap 3.4, breng het monster van 50:50 DW:methanol over in nette methanol (herhaal 2x met methanol zoals in stap 3.5); 3) stap 3.6, breng het specimen over van methanol naar 50:50 methanol:methylsalicylaat; en 4) stap 3.7, breng het exemplaar van 50:50 methanol: MS naar nette MS (herhaal 2x met MS zoals in stap 3.8).
Omdat methylsalicylaat polystyreen plasticware snel verzacht, gebruiken we een geanodiseerde aluminium schotel met een dekselglazen bodem om de verduidelijkte biofilm op het podium van een omgekeerde microscoop te houden. Het afdekglas wordt op zijn plaats gehouden met behulp van UV-uithardend optisch cement (Norland Optical Adhesive #61, zie Tafel van Materialen). Op voorwaarde dat de MS wordt verwijderd aan het eind van de dag door het wassen van de schotel met isopropanol gevolgd door zeepwater en spoelen, zal de gecementeerde deksel glas dienen voor vele maanden.
Objectieve lensselectie is van cruciaal belang bij grootschalige beeldvorming van verduidelijkte specimens vanwege het belang van het minimaliseren van sferische aberratie en de noodzaak van voldoende werkafstand. We hebben ervaring met drie doelstellingen in deze studies. In de omgekeerde microscoop setup, gebruiken we een lange werkafstand, matige numerieke diafragma (NA) objectieve olie ondergedompeld onder de cover glas met de biofilm ondergedompeld in methylsalicylaat in de schotel boven het deksel glas. Het grootste deel van ons werk is gedaan met een Zeiss Universal serie achromatische doelstelling, type 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, gebruikt met een negatieve 160 mm brandpuntsafstand adapter voor nominale oneindig-conjugaat (IC) compatibiliteit. Deze doelstelling is oorspronkelijk ontworpen voor olie ondergedompeld bekijken door middel van 1,5 mm microscoop dia’s met 0,35 mm werkafstand25. Bij gebruik met een standaard afdekglas (0,17 mm) is de werkafstand veel groter: 1,5 + 0,35–0,17 = 1,68 mm = 1.680 μm. We maken ook gebruik van een nieuwe Zeiss multi-onderdompeling doelstelling, type 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat met een werkafstand van meer dan 540 μm, met de onderdompeling correctie ingesteld op de hoge kant van ‘olie’. Deze doelstelling wordt zeer gecorrigeerd en produceert een prachtig beeld. Op een rechtopstaande microscoopstandaard hebben we gebruik gemaakt van een nieuwe Nikon multi-immersion doelstelling, type MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat met een werkafstand van meer dan 5.000 μm (5 mm), ook met de onderdompelingscorrectie ingesteld op de hoge kant van ‘olie’ (n = 1.518). Hoewel deze doelstelling een lagere NA heeft dan de anderen, heeft het het voordeel dat het direct onderdompelbaar is in methylsalicylaat.
Om de gegevensverwerving in termen van snelheid en resolutie te optimaliseren, moeten confocale microscoopinstellingen idealiter voldoen aan zowel transversale als axiale Nyquist-bemonsteringsdichtheid18. Stel de confocale pinholediameter nominaal in op 1 Airy-eenheid. In vergrote coördinaten,
dP (μm) = 1,22 x vergroting x (emissiegolflengte in μm) / NA
Transversale bemonstering (pixelafstand) mag de resolutielimiet van Abbe niet overschrijden (1/2). In objectspaördinaten
∙x, ∙y = (emissiegolflengte in nm) / (4 NA)
Axiale bemonstering (focustoename) mag de omgekeerde axiale bandbreedte niet overschrijden,
∙z = (onderdompelingsindex) x (emissiegolflengte in nm) / (NA2)
Het confocale optische systeem breidt de bandbreedte van de microscoop uit en scherpt zowel de transversale als axiale resolutie met ten minste 1/√2.
Voor de 40x 0.85 NA doelstelling die we het vaakst gebruiken, zie tabel 1 voor de resultaten van deze formules voor een 600 nm emissiegolflengte (Alexa Fluor 594).
| Formule | x 1/√2 | set (typisch) | |
| dP (μm) | 34,5 μm | – | 25 of 50 μm |
| ∙x, ∙y | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
| ∙z | 1200 nm | 848 nm | 900 nm |
Tabel 1: Confocale pinhole diameter, transversale bemonstering, en axiale bemonstering waarden voor een 600 nm emissie golflengte.
Met behulp van een spin-disk confocale scanner met deze instellingen en een 1.392 x 1.040 pixel scan veld, gegevens van biofilm exemplaren kunnen worden verkregen met een redelijke snelheid en resolutie. Typische 3D-afbeeldingsstapels met één kleur draaien 0,35 tot 1,55 GB.
Verduidelijkingsmedia bij breed gebruik omvatten een aanzienlijk brekingsindexbereik. Door darkfield verlichting en visuele inspectie, vonden we dat vaste C. albicans biofilms waren het meest transparant boven n = 1,5. Dit werd verfijnd door fase contrast microscopie naar n = 1.530–1.535. Om een aantal praktische redenen gebruiken we methylsalicylaat (n = 1.537) als de uiteindelijke index die overeenkomt met oplosmiddel. Hoewel oplosmiddeluitwisseling het risico van modelvervorming of andere artefacten met zich meebrengt, hebben cellen in vaste, verduidelijkte specimens vergelijkbare cellichaamsafmetingen, hyphadiameter en interseptale lengteafmetingen als levende specimens.
Veel variaties in het oplosmiddeluitwisselingsproces zijn mogelijk (bijvoorbeeld met behulp van een ander overgangsoplosmiddel, of een ander eindoplosmiddel). Methanol werd gekozen vanwege zijn hoge polariteit en snelle diffusie, maar ethanol bleek beter te behouden rode fluorescerende eiwitten (RFP) quantum opbrengst26 als een overgangsoplosmiddel. Methylsalicylaat werd geselecteerd voor zijn index, matige polariteit, lage dampdruk en compatibiliteit met veel vlekken, kleurstoffen en fluorescerende eiwitten. Echter, een laatste oplosmiddel met iets lagere index, of een mengsel van methylsalicylaat en een lagere index oplosmiddel, zoals butanol, kan beter dienen.
Onverwacht, de mogelijkheid om te zien door middel van een biofilm onthult niet alleen de gelaagde interne kenmerken, maar helpt ook bij het bekijken van de oorsprong van uitgebreide structuren, zoals lange, onverstrengelde apicalhyphae en invasieve basale hyphae op bepaalde substrata. Opportunistische virulentie in C. albicans hangt af van zijn genetische veelzijdigheid (d.w.z. omschakeling naar hyphal groei, upregulatie van celsubstratum en cel-cel aanhankelijkheid, generatie van osmolyten voor cel ontluikende en verlenging, en het gebruik van alternatieve voedingsstoffen). Hyphal extensie maakt breakout van individuele C. albicans cellen uit fagocytische immuuncellen, maar is ook essentieel voor invasie. Biofilm hechting en hyphal verstrengeling lijken te bieden het oppervlak verankering die nodig is voor hyphae om efficiënt binnen te vallen een substratum. Wanneer dat substratum gastheerweefsel is, kan verhoogde virulentie het gevolg zijn.
Beeldvorming intacte biofilms maakt een groot aantal informatieve experimenten met behulp van reporter stammen voor genexpressie, model weefsel substrata, en de opname van andere organismen zoals bacteriën gevonden in natuurlijke biofilms. Zelfs in het eenvoudigste geval van zuiver structurele beeldvorming met een celwandvlek, worden in situ fenotypes onthuld die vervolgens kunnen worden gekwantificeerd en genetisch geanalyseerd.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidies R01 AI067703, R21 AI100270, en R21 AI135178 aan A.P. Mitchell. De auteurs zijn Greenfield ‘Kip’ Sluder dankbaar voor het verstrekken van de lange werkafstand olie onderdompeling doelstelling gebruikt in dit werk, en daniel Shiwarski voor confocale microscopie met directe methyl salicylate onderdompeling.
Materials
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator – 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator – 37 deg C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive – type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL – Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
Referencias
- Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
- Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144 (2017).
- Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
- Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
- Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226 (2018).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
- Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525 (2012).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
- Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
- Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487 (2016).
- Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787 (2019).
- Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
- Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, 1601-1613 (1991).
- Lanni, F., Keller, H. E., Yuste, R. M. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. , 1-55 (2011).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
- Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , 48 (1971).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113 (2008).
