Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm

La legionella pneumophila (L. pneumophila), l’agente eziologico della malattia dei Legionari, abita serbatoi d’acqua dolce, dove i batteri si propagano infettando e replicandoalli protozoi acquatici di nuoto libero. L. pneumophila provoca focolai di malattia nell’uomo quando si verifica l’inalazione di batteri aerosolizzati da fonti di acqua potabile. Nelle cellule infette, la sovversione delle vie ospiti consente a L. pneumophila di ritardare la maturazione endocitica del vacuolo in cui risiede e di promuovere la biogenesi di un compartimento cellulare che supporta la replicazione batterica. Questo processo è guidato da un sistema di secrezione iVB di tipo batterico specializzato (T4BSS) noto come Punto/Icm e dal suo repertorio di oltre 300 proteine “effettore” che vengono traslocate nel citosol ospite durante l’infezione per facilitare la manipolazione delle funzioni cellulari^1,2,3,4. I mutanti privi di un apparato funzionale Dot/Icm non riescono a fornire gli effettisori nel citosol ospite, sono difettosi per la replicazione intracellulare e sono avirulenti nei modelli animali della malattia^6,7.

Molte specie batteriche hanno sviluppato macchine multicomponente estremamente complesse e dinamiche che sono necessarie per i processi di infezione. Altri T4BSS come il sistema Dot/Icm sono essenziali anche per la replicazione intracellulare di patogeni batterici come Coxiella burnetii e Rickettsiella grylli. Sebbene i T4BSS siano evolutivamente correlati a sistemi prototipici di IVA di tipo, che mediano il trasferimento del DNA e possono fornire un repertorio limitato di proteine efvigoreri, il sistema Dot/Icm ha quasi il doppio dei componenti della macchina e offre un’ampia varietà di eseguzioni. Presumibilmente, questa espansione del numero di componenti ha permesso all’apparato Punto/Icm di ospitare e integrare facilmente nuovi effaranti^8,9.

Recentemente abbiamo usato la tomografia crioelettronica (crio-ET) per risolvere la struttura dell’apparato Punto/Icm in situ e abbiamo dimostrato che forma un canale di involucro cellulare che si collega a un complesso citoplastico. Ulteriori analisi hanno rivelato che il citosolico ATPase DotB si associa al sistema Dot/Icm al polo cellulare L. pneumophila attraverso interazioni con il citosolico ATPase DotO. Abbiamo scoperto che DotB mostra un movimento citosolico nella maggior parte delle cellule batteriche, indicando che questo ATPase è presente in una popolazione citosolica dinamica, ma si associa anche ai complessi polari Dot/Icm. Inoltre, DotO forma un assemblaggio hexameric di dimeri DotO associati al complesso della membrana interna, e un esamemerDot si unisce alla base di questo complesso citoplasmatico. L’assemblaggio del complesso energetico DotB-DotO crea un canale citoplasmico che dirige la traslocazione dei substrati attraverso il T4SS (Figura 1)¹⁰.

Nonostante questi recenti progressi, si sa poco su come funziona il sistema Dot/Icm e su come ogni proteina si assembla per formare un apparato attivo⁸. Scoprire i circuiti regolatori del Dot/Icm T4SS è fondamentale per comprendere i meccanismi molecolari delle interazioni host-patogen. Pertanto, discutiamo come utilizzare la microscopia a cellule vive e il crio-ET per rilevare e caratterizzare i componenti essenziali del sistema L. pneumophila Dot/Icm che sono contrassegnati con GFP super-folder (sfGFP). Utilizzando la microscopia quantitativa a fluorescenza, la localizzazione polare di DotB sarà definita in uno sfondo di tipo selvaggio o quando il sistema di tipo IV viene eliminato. La microscopia time-lapse sarà utilizzata per quantificare le differenze nella localizzazione e nella dinamica tra l’ATPases citosolico Dot/Icm.

L’applicazione combinata di due approcci complementari come l’imaging dal vivo e il crio-ET offre un vantaggio rispetto ad altri sistemi in vitro. Entrambi i metodi vengono eseguiti in celle intatte e preservano l’ambiente naturale del T4BSS, riducendo così al minimo l’interruzione della struttura nativa durante la preparazione del campione. Poiché la sovraespressione delle proteine può compromettere la stoichiometria dell’apparato di secrezione, le fusioni sfGFP vengono restituite attraverso lo scambio allelico al cromosoma Legionella in modo che ogni fusione sia codificata in una singola copia e l’espressione sia guidata dal promotore endogeno. La visualizzazione di fusioni cromosomiche con codifica consente la quantificazione dell’esatto livello di proteina espresso in un momento definito. Cryo-ET ha anche molti vantaggi per determinare la struttura dei sistemi di secrezione. Il vantaggio più notevole è che i campioni di crio-ET sono costituiti da cellule intatte congelate che conservano complessi nativi nel contesto dell’architettura delle cellule batteriche. Di conseguenza, il crio-ET può essere preferibile agli approcci di purificazione biochimica, che estraggono complessi di membrana e possono privare le proteine periferiche dall’apparato centrale o modificare la struttura complessiva. Inoltre, etichettare una proteina di interesse con una proteina ingombrante come sfGFP aggiunge una massa rilevabile dal crio-ET e può aiutare a mappare i diversi sottocomplessi dell’apparato Punto/Icm sulla struttura ottenuta da cryo-ET.

Questo approccio è un potente strumento per scoprire informazioni strutturali sui complessi multimolecolari che si assemblano nella membrana cellulare batterica. L’interpretazione delle strutture chiarite utilizzando queste tecniche aiuterà il campo a capire come funzionano i componenti T4BSS, perché così tanti componenti sono necessari per la funzione, come i componenti interagiscono all’interno del complesso maggiore e quali funzioni questi i sottoassiemi vengono eseguiti.