微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析

1. バッファーおよび試薬の調製 塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カリウム(KCl)2g、水素二ナトリウム二水和物14.4g(Na2HPO4・2H2O)、カリウムジ水素リン酸カリウム2g(KH2PO4)を2重蒸留した1回の1ラズフラスコに2g添加して、10倍のリン酸緩衝液(10x PBS)を調製する。 10x PBS溶液をオートクレーブし、この溶液の100 mLを900mLの二重蒸留水で希釈して1x PBSを得た。 オートクレーブを使用して溶液を殺菌します。ガラスフラスコをバスケットに入れ、蓋を閉め、121°Cと98.9 kPaで15分間殺菌します。注: このプロトコルは、常に、さらに手順でソリューションを自動クレーブするために使用されます。 0.5 mg/mLフィブロネクチン溶液と0.3 mg/mLコラーゲンIV溶液を1x PBSで1.5 mLマイクロチューブで100mg/μLアリコートで希釈して、10μg/mLコラーゲンIVおよび10μg/mLコラーゲンIV溶液を調製します。その後、2 mLマイクロチューブに1,800 μLのPBSを1,800 μLと混合し、-20°Cに保存します。 DMEM/F-12培地を4%ウシ胎児血清と2mM L-グルタミン、100mg/Lペニシリン/ストレプトマイシンを培地に添加して調製し、4°Cで保存する。 10倍濃縮トリプシンEDTA溶液の5mLを50mLのPBSで45 mLの1x PBSで希釈して、10mLのトリプシン-EDTA溶液を50mLのチューブに調製し、4°Cで保存する。 500 mL ガラスフラスコにLBブロスベース10gの重さを計量して、LB培地500mLを調製する。殺菌水500mLを加え、オートクレーブします。 500 mLガラスフラスコにLBブロスベース10g、寒天7.5gの重量を量ってLB寒天を調製します。オートクレーブする前に500mLの殺菌水を加え、フラスコの蓋を閉めないでください。オートクレーブとそれがタッチに暖かくなるまで冷却するソリューションを残します。 4%のウシ胎児血清と2mM L-グルタミンを添加して抗生物質を含まない培地を調製し、DMEM/F-12培地にペニシリン/ストレプトマイシンを添加し、ステップ1.3のように4°Cで保存します。 2. 細胞を模倣する血液脳関門の成長 12ウェルプレートを組み立てるには、細胞培養インサートをウェルに入れます(図2A)。 プレートと各インサートを生物学的安全キャビネットに開梱し、そこでさらに手順を実行します。滅菌鉗子を使用して、幅広いベースでインサートをつかんで動かします。 各インサートの多孔質膜を90 μg/mLコラーゲンIVと10 μg/mLフィブロネクチン混合物でコーティングします。細胞培養インキュベーターで37°Cで24時間の12ウェルプレートをインキュベートする(図2B)。 1x PBSの1mLを各インサートにピペッティングしてインサートを2回洗浄し、細胞培養用の真空ポンプで溶液を吸引します。 上部に0.5 mLのプレウォーミングDMEM/F-12培地、下側チャンバーに1.5mLをピペッティングして膜を平衡化します。5%のCO2雰囲気を有する細胞培養インキュベーターで37°Cでプレートを30分間インキュベートする(図2C)。 種子2 x105ヒト微小血管内皮細胞を各上部チャンバーに入れ、細胞培養インキュベーターで37°Cで12ウェルプレートをインキュベートする(図2D)。 細胞培養用の真空ポンプを用いて菌体培養フラスコから培地を吸引し、1x PBSの10mLをピペッティングし、その後真空ポンプで溶液を吸着させることで単層を洗浄する。 細胞を1x濃縮トリプシンEDTAで完全に覆い、5 mLの溶液を細胞培養フラスコにピペッティングして、37°Cで3〜5分間フラスコを細胞培養インキュベーターでインキュベートする。注:細胞が解き消されない場合は、手のひらにフラスコをしっかりとタップして細胞を外します。 15 mLチューブの細胞懸濁液からアリコートとしてピペットを用いて5 mLを取り、5 mLのFCS含有培地を加えて酵素反応を停止させます。 210 x gで懸濁液を3分間遠心分離し、真空ポンプで上清を取り除き、ペレットをピペットで5 mLの培地に再懸濁します。 セルカウンターを使用して、1.5 mLマイクロチューブに10μLのトリパンブルー染色を10μLで混合します。10 μLの混合物をカウントチャンバースライドに加え、セルカウンターに入れ、カウントを開始します。 セルの端が濃い青色、中央が白になるように、セルにカウンターを合わせます。その後、セルカウントのための適切なプログラムを開始します。 各挿入物の体積を計算するために、得られた2 x105細胞を挿入ごとに、細胞懸濁液の算出濃度で除算する。 血液脳関門モデルの培養 12ウェルプレートを37°Cで14日間インキュベートする。 上チャンバーの培地の0.5 mLと2〜3日ごとに下側の培地用の1.5 mLを変更します。培地を細胞フラスコに入れる前に温めます。真空ポンプで吸引する (図 2E)。メモ:メンブレンに触れないように注意してください。 顕微鏡で細胞をイメージングして細胞の状態を確認し、その合流状況を確認します。14日後に合流率が100%であることを確認してください。 4. 細菌の製造 測定の前日、大腸菌株GM2163のコロニーをLB培地に入れる。培養用の培養管を37°Cで24時間インキュベートし、180rpmでインキュベーションシェーカー(図2F)を使用します。 4°CでLB寒天板上の大腸菌株を培養する。滅菌ピックで1つのコロニーを取り、LB培地の3 mLで準備された培養管にピックを入れます。 暖かいLB寒天溶液で各インサートのためのLB寒天プレートを準備し、その総量の半分にペトリ料理を埋めます。固体にし、4°Cに保管しましょう。 5. 細胞の治療 播種後14日目に、化合物を用いて細胞を治療するか、または、計画されている場合は経内皮電気抵抗(TEER)を測定する(図2G)。注: コントロールとして未処理のセルを常に持つ。 目的の化合物を用いて細胞を治療するには、化合物をDMEM/F-12培地の最終濃度に希釈します。この混合物の0.5 mLを上部チャンバーに加え、下側チャンバーに1.5mLを加えます。所望の時間に対して、細胞培養インキュベーターでプレートをインキュベートする。 その後、真空ポンプとピペッティングを通して、完全な培地を抗生物質を含まない培地と交換します(図2H)。 6. 透透度測定 細菌の濃度を一定にするには、光度計を600nmの波長で測定します。50 mLのハヤブサチューブに含まれるLB培地で細菌の一晩溶液を0.5±0.05のOD600に希釈します。氷の上で作業します。 1 mL の LB 培地をキュベットに入します。光計を起動し、前面にマークされた、キュベットを入れます。その後、空白値を測定するために下部のブランクを押します。 細菌溶液をキュベットに充填し、入れ、下部サンプルを押すことで、細菌溶液の密度を測定します。希釈中に測定を繰り返し、最終濃度になるまで測定します。 OD600 = 0.5で調製した12ウェルプレートおよび細菌溶液で細菌を処理することができる生物学的安全キャビネットで作業します。450 μLの細菌溶液を、培地0.5mLを含む各上部チャンバーに添加する(図2I)。 12ウェルプレートを37°Cで6時間インキュベートします。注: プロトコルはここで一時停止するように指示します。 鉗子で挿入物を取り出すことによって各下のチャンバーからピペットを用いた培地のサンプル50μL(図2J)。上の部屋から下の部屋に媒体をこぼしないように注意してください。 各サンプルを別々の寒天プレート(図2K)にプレートします。プレートにサンプルをドロップし、セルスプレッダーで溶液をストリークします。 37 °Cで寒天プレートを24時間インキュベートします。 各プレートにコロニーを数えます(図2L)。 7. データの分析 表にデータを書き込み、処理された細胞と未処理の細胞の観測されたコロニーの平均および標準偏差を計算する。 平均をコロニーの絶対数として表示する。 結果を正規化するには、全ての結果を制御値で割ることによりコロニーの相対数を算出する。 図2:プロトコルの個々のステップの詳細なプレゼンテーション。(A) 殺菌した鉗子を入れたインサートを12ウェルプレートに入れます。(B) 90 μLのフィブロネクチンとコラーゲンIV混合物を塗布し、24時間インキュベートし(C)30分間のプレウォーム培地で膜を平衡化する(D)種子2 x105ヒト脳微小血管内皮細胞(E) 適切な時間だけプレートを培養します。(F) 測定の前日に、LB培地培養管に大腸菌コロニーを入れ、24時間(G)細胞を治療するか、TEERを測定する。(H) 抗生物質を含まない培地との交換の完全な培地。(I)細菌溶液450μL(OD600 = 0.5)を各上部チャンバに加え、6時間(J)サンプル50μLの培地を各下側チャンバーから50μLのインキュベートして鉗子で挿入する。(K) 試料を寒天プレートにプレートし、24時間インキュベートします(L)コロニーを数え、データを分析します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。